在衰老进程中LincRNA-CNOT6/GFAT2的调控作用及淫羊藿苷延缓HUVEC衰老的机制研究

来源 :上海中医药大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:wangliang284
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目的:人口老龄化趋势已在全球蔓延开来,我国是较早进入人口老龄化社会的发展中国家之一。老龄化人口基数大,增长速度迅猛已对我国的社会结构产生严重影响,且衰老与高血压、骨质疏松、呼吸系统疾病以及肿瘤等密切相关。中药可以作用于表观遗传的多个环节,影响衰老,而lnc RNA为目前表观遗传调控的方向之一。淫羊藿苷作为传统补肾阳中药淫羊藿的有效成分之一,其延缓衰老的作用正受到广泛关注。淫羊藿苷的药理作用可能是通过调控lnc RNA来发挥药理作用。因此,本课题以人源细胞为研究对象,以衰老相关的lnc RNA为研究重点,揭示补肾中药活性成分淫羊藿苷延缓细胞衰老的作用机制。方法:1.通过LNCipedia数据库对linc RNA-CNOT6的基因位点保守性进行分析;通过BLAST软件(NCBI数据库)进行RNA序列保守性分析。2.RT-sq PCR法检测Linc RNA-CNOT6在人源细胞系L02、Wi38、HUVEC、Hep G2、SMMC-7721、H1650中的表达情况。3.RT-sq PCR法检测Linc RNA-CNOT6在细胞中的定位。4.在HUVEC细胞中过表达Linc RNA-CNOT6,RT-sq PCR法检测对衰老相关因子及GFAT2、SCGB3A1、MAPK9基因表达水平的影响;Western Blot法检测对衰老相关因子及GFAT2蛋白表达水平的影响。5.在WI-38细胞中过表达Linc RNA-CNOT6,RT-sq PCR法检测对衰老相关因子及GFAT2、SCGB3A1、MAPK9基因表达水平的影响。6.在H1650细胞中过表达Linc RNA-CNOT6,RT-sq PCR法检测对衰老相关因子及GFAT2、SCGB3A1、MAPK9、FLT4、CNOT6基因表达水平的影响;β-半乳糖苷酶染色法评价衰老细胞比例。7.RT-sq PCR法检测中药单体(50μM)对年轻HUVEC细胞(PDL≤25)和衰老HUVEC细胞(PDL≥50)中Linc RNA-CNOT6、p21、GFAT2基因表达的影响。8.脱水淫羊藿素(50μM)、淫羊藿苷(50μM)分别处理H2O2诱导的HUVEC衰老模型48 h,β-半乳糖苷酶染色法评价衰老细胞比例的变化。9.不同浓度淫羊藿苷(0~50μM)处理H2O2诱导的HUVEC衰老模型48h,RT-sq PCR法检测Linc RNA-CNOT6、p16、p21、p53、GFAT2基因水平的变化;Western Blot法检测P16、P21、P53、GFAT2蛋白水平的变化。结果:1.Linc RNA-CNOT6在果蝇、斑马鱼、小鼠、黑猩猩基因组中不存在此位点,且序列与NCBI网站数据库中序列相似度低,种属特异性高,提示linc RNA-CNOT6为人类特有的linc RNA。2.Linc RNA-CNOT6在人源正常细胞系L02、Wi38、HUVEC和人源肿瘤细胞系Hep G2、SMMC-7721、H1650中均能检测到,说明Linc RNA-CNOT6在人体中表达具有广泛性。3.18S、GAPDH主要分布在细胞浆中,Linc RNA-CNOT6、MALAT1主要分布在细胞核中,提示Linc RNA-CNOT6定位于细胞核。4.在HUVEC细胞中,过表达Linc RNA-CNOT6可以降低p16,p21,p53基因的表达水平,并降低GFAT2基因的表达。同时在HUVEC细胞中过表达Linc RNA-CNOT6也可降低P16和P21蛋白的表达水平。5.在WI-38细胞中,过表达Linc RNA-CNOT6可降低衰老相关基因和GFAT2基因的表达水平。6.在H1650细胞中,过表达Linc RNA-CNOT6可降低衰老相关基因和GFAT2基因的表达水平,并显著降低衰老细胞比例。7.淫羊藿苷、脱水淫羊藿素可提高年轻HUVEC细胞(PDL≤25)中Linc RNA-CNOT6基因的表达水平,但对p21、GFAT2基因的表达水平无显著影响。8.淫羊藿苷可上调衰老HUVEC细胞(PDL≥50)中Linc RNA-CNOT6基因的表达水平,并下调p21基因的表达,但对GFAT2基因表达水平无显著影响。9.在H2O2诱导的HUVEC衰老模型中,淫羊藿苷处理显著降低细胞衰老比例,且与模型组相比差异显著。淫羊藿苷还能降低衰老模型中p21基因和P53蛋白的表达水平。结论:1.Linc RNA-CNOT6作为人类特有的linc RNA,主要定位于细胞核。2.过表达Linc RNA-CNOT6,可降低衰老相关因子及GFAT2的表达水平,这一现象可能在人源细胞中普遍存在。3.淫羊藿苷通过上调HUVEC中Linc RNA-CNOT6的表达,抑制GFAT2的表达水平,从而延缓HUVEC衰老进程。
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