论文部分内容阅读
布鲁氏菌病是一种严重的人兽共患病，布鲁氏菌侵入机体后，经历短暂的急性期后很容易转成慢性感染，主要寄生在宿主的巨噬细胞内，而巨噬细胞可根据体内微环境的不同，极化为不同的表型发挥不同的功能。布鲁氏菌感染对巨噬细胞的极化影响很大，但其具体分子机制尚未系统研究，本文主要研究布鲁氏菌感染巨噬细胞后对其极化方向的影响，以及对参与抗炎反应和组织修复功能的M2型和参与调控M2的信号通路STAT6的影响。 目的：本研究以布鲁氏菌强毒株16M、S2308和布鲁氏菌弱毒株M5和RB51为研究对象，探讨布鲁氏菌对巨噬细胞极化方向的影响以及STAT6信号通路对布鲁氏菌胞内生存的影响，并在小鼠体内验证STAT6的表达情况，最后验证布鲁氏菌外膜蛋白Omp10和脂多糖蛋白Per对巨噬细胞极化的影响以及对STAT6信号通路的影响。 方法：（1）分离获取小鼠骨髓细胞，以M-CSF诱导巨噬细胞分化，后加入IL-4刺激向M2型分化。流式细胞术鉴定巨噬细胞分化程度及M2型巨噬细胞极化比例；qRT-PCR检测M2型转录因子JAK1、STAT6、ARG1、Ym1、IL-10的mRNA相对表达量；再通过免疫荧光技术检测M2型标志因子ARG1、CD206；最后利用ELISA检测M2型细胞因子IL-10的表达情况。（2）利用羊种布鲁氏菌16M和M5，牛种布鲁氏菌S2308和RB51侵染细胞，qRT-PCR检测M1型巨噬细胞标志因子p65、NOS2和IL-1β和M2型巨噬细胞标志因子JAK1、STAT6、ARG1、IL-10mRNA表达水平。然后利用WesternBlot检测STAT6信号通路的激活状态。其次利用流式细胞术检测M1/M2标志性表面标记CD86和CD206的表达比例。再通过ELISA检测M1/M2型细胞因子TNF-α、IL-12、IL-4、IL-10的表达。最后进行CFU计数。（3）建立小鼠攻毒模型，分别于攻毒3、9、15、30、45天后断尾采血，ELISA方法检测小鼠体内细胞因子IL-12、IL-10、IL-4，IFN-γ的表达量。处死后无菌取出其心，肝，脾，肺，肾，子宫，提取各组织RNA，qRT-PCR方法检测，各组织内STAT6mRNA的表达水平；并做CFU计数；HE染色观察组织的病变；免疫组化检测不同组织中布鲁氏菌与STAT6、p-STAT6的表达。（4）首先纯化重组表达蛋白Omp10和Per，再分别刺激巨噬细胞，qRT-PCR检测M1型标志因子NOS2和IL-12，M2型标志因子JAK1、STAT6、ARG1、IL-10mRNA表达水平；然后流式细胞仪检测蛋白刺激细胞后CD86和CD206的表达。ELISA方法检测Th1/Th2型细胞因子TNF-α和IL-10的表达量。 结果：（1）在分化第8天时，巨噬细胞比例达95%。经IL-4诱导24h后，JAK1、STAT6、ARG1、Ym1、IL-10mRNA相对表达量均显著上调；ARG1、CD206荧光表达量均达到90%以上且M2型巨噬细胞标志CD206比例达97%；IL-10的表达量显著高于对照组。（2）布鲁氏菌侵染细胞前期高表达M1相关因子p65、NOS2、IL-1β和CD86，而后期高表达M2相关因子JAK1、STAT6、ARG1、IL-10和CD206。布鲁氏菌在感染72h时激活STAT6信号通路，且强毒株16M和S2308强于弱毒株M5。加入STAT6抑制剂后，抑制IL-4、IL-10的表达；促进TNF-α、IL-12的表达。布鲁氏菌感染分别激活和抑制STAT6后的细胞，加入IL-4激活STAT6后，胞内载菌量高于对照组，而加入AS抑制STAT6后，胞内载菌量低于对照组。（3）布鲁氏菌M5攻毒小鼠脾脏载菌量第9天达到最大后逐渐减少。各组织的病理变化在布鲁氏菌感染9天和15天时最严重，45天后减轻。布鲁氏菌M5对M1型细胞因子IL-12和IFN-γ在感染初期3、9、15天显著高于对照组，而M2型细胞因子IL-10、IL-4，在感染后期45天时，显著高于对照组。脾脏内STAT6的表达呈上调趋势；肾脏中在感染15天和45天是显著上调差异显著；子宫中STAT6的表达在感染45d时达到最高水平。（4）Omp10蛋白刺激细胞后，JAK1、STAT6的相对表达量在12h时，显著下调；ARG1和IL-10表达水平在48h时显著上调。NOS2和IL-12在4h和12h显著上调，刺激12h后CD86表达显著高于BSA对照组，72h后显著降低。CD206表达显著低于对照组，72h后显著上升。TNF-α的表达前期显著高于对照组。IL-10的表达在刺激48h时，显著高于对照组。Per蛋白刺激细胞后JAK1、STAT6无差异影响，ARG1和IL-10表达下调，NOS2和IL-12显著上调，12h达到最高水平后逐渐下降，刺激12h后CD86表达显著高于BSA对照组，72h后显著降低。而CD206表达显著低于对照组。TNF-α的表达前期显著高于对照组。 结论：（1）成功建立了骨髓源性巨噬细胞的体外培养体系和稳定的M2型巨噬细胞极化模型。（2）布鲁氏菌感染前期诱导M1型巨噬细胞表型，感染后期诱导M2型。在感染后期激活STAT6信号通路，且增强布鲁氏菌胞内生存能力，强毒株16M和S2308强于弱毒株M5。（3）STAT6信号通路在感染后期（45天后）在小鼠脾脏，子宫和肾脏中表达。（4）外膜蛋白Omp10和脂多糖蛋白Per抑制STAT6信号通路的激活，在刺激前期主要诱导巨噬细胞极化为M1型且Per强于Omp10的诱导能力。Omp10在感染48h后诱导M2型因子，但Per无影响。