研究背景脊髓压迫性损伤(Compressed spinal cord injury,CSCI)是一组具有占位性特征的椎管内病变,通常由黄韧带硬化、椎骨骨折、髓内肿瘤等造成,是神经系统的常见疾患。其临床表现为脊髓受压平面以下的运动、感觉、反射及括约肌功能部分或全部障碍。如果没有解除压迫,及时治疗,将会发生不可逆的功能丧失,给患者的身体和心理带来严重伤害,进而对患者的家庭和社会带来极大的负担。髓鞘在中枢神经系统中是由少突胶质细胞(Oligodendrocytes,OLs)形成的,它是包绕在神经元轴突外面的一层髓磷脂膜结构。髓鞘在神经系统中起到对轴突及周围组织的支持作用;并以―跳跃式传导”确保动作电位准确、快速的传递以及在轴突受损时引导轴突再生。有研究发现,OLs的凋亡和脱髓鞘是CSCI最显著的病理改变。髓鞘结构的完整确保了动作电位的“跳跃式传导”,所以髓鞘一旦脱失,神经冲动的传导必然会受到阻滞或泛化,进而影响神经系统的功能,极大地降低患者的生活质量。因此,如何减少OLs的损伤,避免髓鞘的脱失,是脊髓损伤修复研究的重点领域之一。然而,目前有关CSCI脱髓鞘的机制尚未完全阐明,因此,进一步探讨其发病机理,寻求一种有效的防止髓鞘脱失、恢复神经冲动正常传导的治疗方法是当前一个亟待解决的问题。为此,本实验拟在制作CSCI动物及细胞模型的基础上,采用透射电镜(transmission electron microscopy,TEM),免疫荧光染色,蛋白质印迹(western blot),流式细胞术(Flow cytometry,FCM)等实验方法,重点对p53在CSCI脱髓鞘病变中的作用及其机制着手进行研究,进一步阐明CSCI脱髓鞘病变的分子机制,为临床治疗提供实验基础。目的1.制作模型探讨p53是否在CSCI脱髓鞘病变中发挥作用。2.用p53特异性抑制剂PFT-μ,对CSCI模型动物及OLs体外培养的细胞模型进行干预,观察干预前后有髓神经纤维髓鞘/OLs的变化,研究OLs凋亡与CSCI脱髓鞘病变之间的关系,进一步阐明p53在脱髓鞘病变中的作用及其机制。方法1.健康成年雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠63只,随机分为正常组(n=7)、假手术组(n=7)和CSCI组。CSCI组又进一步分为CSCI 1h组(n=7)、CSCI 3h组(n=7)、CSCI 12h组(n=7)、CSCI 1d组(n=7)、CSCI 3d组(n=7)、CSCI 7d组(n=7)及CSCI14d组(n=7)。正常组给予常规饮食,不做任何干预;假手术组仅切开椎板,不进行压迫;CSCI组则在行椎板切除术后采用本课题组自行研制的压迫器压迫脊髓2h后减压。BBB(Basso,Beattie,and Bresnahan)运动功能评分检测损伤后1d、3d、7d、14d大鼠后肢的运动功能;锇酸染色及TEM观察CSCI后不同时间点大鼠有髓神经纤维形态学改变及数量上的变化;western blot检测CSCI后1h、3h、12h、1d、3d、7d及14d髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP),p53,E2F1,active caspase-3,caspase-12及cytochrome C的表达变化;免疫荧光三标检测p53,E2F1,active caspase-3的共表达及caspase-12、cytochrome C与OLs表面标记物—环核苷酸磷酸二酯酶(Cyclic neucleotide phosphodiesterase,CNPase)的共表达。2.取SD乳鼠皮质,采用B104条件培养基(the conditioned medium prepared from B104 neuroblastoma cells,B104CM)增殖培养结合EDTA消化机械吹打分离纯化法培养少突胶质前体细胞(Oligodendrocyte progenitor cells,OPCs)。对纯化后的OPCs更换分化培养基培养3d,使OPCs向OLs方向分化。3.通过氧糖剥夺建立CSCI细胞模型,然后将OLs分为3组:正常组、CSCI细胞模型组、PFT-μ组。FCM检测各组细胞的凋亡及线粒体膜电位的变化。western blot检测各组细胞E2F1,active caspase-3,caspase-12及cytochrome C的表达变化;免疫荧光检测active caspase-3在CNPase细胞中的表达及caspase-12、cytochrome C在CNPase细胞的共表达。4.进一步在动物模型上证实细胞实验所得出的结论。将45只雌性SD大鼠分为假手术组(n=15)、PFT-μ组(n=15)及对照组(n=15)。BBB评分检测CSCI后1d、3d、7d、14d各组大鼠后肢的运动功能;锇酸染色和TEM观察CSCI 7d时各组大鼠有髓神经纤维数量及结构的变化;western blot检测损伤7d后各组大鼠MBP,E2F1,active caspase-3,caspase-12及cytochrome C的表达变化;免疫荧光染色检测各组大鼠E2F1,active caspase-3的共表达及caspase-12、cytochrome C与CNPase的共表达。5.用SPSS软件对实验结果进行处理及统计分析。结果1.正常组和假手术组的SD大鼠BBB评分均为21分,而CSCI组大鼠的BBB评分随着压迫损伤后时间的延长而降低,与正常组和假手术组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。锇酸染色和TEM结果显示:在正常组和假手术组,有髓神经纤维在白质中均匀分布;而在CSCI组,随着压迫损伤后时间的延长,有髓神经纤维出现水肿、崩解,并且在数量上逐渐减少(P<0.05)。免疫荧光染色显示:假手术组MBP的免疫反应性高,而损伤后7d,MBP的免疫反应性明显降低;p53,E2F1和active caspase-3的共表达在假手术组呈散在分布,而在CSCI后7d,共表达明显增多;caspase-12+-cytochrome C+-CNPase细胞在假手术组几乎没有分布,但是在损伤后7d,caspase-12+-cytochrome C+-CNPase细胞广泛分布于脊髓的白质。western blot结果显示MBP的蛋白表达量在损伤后逐渐降低(P<0.05);p53,E2F1的蛋白表达水平在损伤后先增加后降低,但都高于正常组和假手术组(P<0.05);active caspase-3,caspase-12及cytochrome C的蛋白表达水平在损伤后逐渐增加(P<0.05)。2.OPCs在B104CM增殖联合EDTA消化机械吹打法培养后用OPC特异性抗体NG2检测,纯度达到95%以上。分化培养基诱导后用MBP(OLs标记物)标记细胞,纯度达90%以上。3.FCM检测正常组、CSCI细胞模型组、PFT-μ组细胞的凋亡率,结果显示CSCI细胞模型组细胞凋亡率最高,PFT-μ组细胞次之,正常组细胞凋亡很少,两两相比,均有统计学意义(P<0.05)。线粒体膜电位检测显示CSCI模型组和PFT-μ组细胞荧光强度均较正常组减弱,但细胞模型组荧光强度明显低于PFT-μ组(P<0.05)。western blot结果显示虽然E2F1,active caspase-3,caspase-12及cytochrome C的蛋白表达水平在CSCI模型组、PFT-μ组均较正常组高,但是在CSCI模型组升高的更为明显(P<0.05)。免疫荧光染色发现active caspase-3在CSCI模型组CNPase细胞中高表达,而在PFT-μ组表达较少;caspase-12+-cytochrome C+-CNPase细胞在CSCI模型组数量较多,而在PFT-μ组呈零星分布。4.PFT-μ干预CSCI大鼠后,大鼠的BBB评分虽然较假手术组低,但明显高于对照组(P<0.05),并且有髓神经纤维数量也较对照组增多(P<0.05)。电镜结果显示:假手术组的髓鞘板层排列紧密,厚薄均一;对照组的神经纤维髓鞘明显水肿,髓鞘板层从神经纤维周围分离、剥脱甚至断裂;PFT-μ组中虽然个别神经纤维髓鞘板层仍有崩解,但大多数神经纤维髓鞘形态趋于正常,并且水肿程度也明显减轻。MBP蛋白表达在PFT-μ组虽然也降低,但明显高于CSCI组(P<0.05)。western blot结果显示,虽然E2F1,active caspase-3,caspase-12及cytochrome C的蛋白表达水平在PFT-μ组和对照组都升高,但在PFT-μ组的升高幅度远远低于对照组(P<0.05)。E2F1和active caspase-3的共表达在PFT-μ组零散分布,而在对照组则广泛存在。caspase-12、cytochrome C阳性的CNPase细胞在PFT-μ组及假手术组的脊髓白质里散在分布,但是广泛分布于对照组。结论1.大鼠CSCI后,发生脱髓鞘病变,致使大鼠的运动功能障碍。随着损伤时间的延长,凋亡相关蛋白p53,E2F1,active caspase-3,caspase-12及cytochrome C的表达逐渐升高,OLs凋亡增多。2.PFT-μ干预动物及细胞CSCI模型后,凋亡相关蛋白表达降低,OLs凋亡减少,脱髓鞘病变得到明显改善。3.CSCI脱髓鞘的发生与p53的高表达有关。p53的高表达可以促进E2F1的表达,导致凋亡的发生;同时,p53的高表达还可以通过内质网应激,cytochrome C介导的线粒体凋亡以及内质网-线粒体之间的相互作用,触发OLs的凋亡,最终导致脱髓鞘的发生。