无细胞蛋白质表达系统作为一种不同于体内蛋白合成的方法,它具有体内表达蛋白所不具有的优点。1)蛋白表达反应操作简便省时,仅需加入抽提物、遗传模板和必需的反应底物,可实现目的蛋白表达；2)可表达体内难以表达或以包涵体形式表达的蛋白,例如对细胞有毒害作用的抗菌肽和膜蛋白；3)反应条件易于控制,可人工控制加入分子伴侣或非天然氨基酸,表达特定蛋白质4)模板形式多样,能够直接以PCR产物或重组质粒作为模板在微孔板上同时平行合成多种蛋白质,满足药物筛选等要求高通量的工作需求。本实验,制备大肠杆菌抽提物,应用不同二次能源系统表达蛋白。在分析不同的反应器特点的基础上,选择最简单的Batch反应器优化出最优的表达eGFP的无细胞表达体系。实验结果显示S12抽提物表达效果良好,与S30抽提物比较,虽然S12抽提物的本底多,但能够高产量表达eGFP。同时不同的能量系统对于无细胞表达体系蛋白的表达效果也是不同的。针对于四种产生ATP的二次能源系统,实验表明,cAMP/CP/CK作为二次能源物质来源的蛋白表达量及eGFP的荧光强度比较高。选择cAMP/CP/CK和S12为基础的无细胞表达体系,优化出最优的实验条件,其优化过程是从多种底物分别展开的。氨基酸的浓度,镁离子浓度,NTP的浓度以及抽提物的活性等都做了优化实验。在此基础上,进一步验证了膜蛋白AqpZ在此无细胞表达体系中的有效表达。无细胞蛋白质合成系统的成功构建为膜蛋白AqpZ的大量表达和功能检测提供了很好的研究基础,这也为采用CECF反应系统表达大量功能性膜蛋白提供了坚实的基础。另外,本系统成功地应用在腺苷酸转运体(ANT)蛋白质的高效表达。