研究背景和目的创伤弧菌溶细胞毒素(vibrio vulnificus cytolysin,VVC)是由创伤弧菌结构基因vvhA编码的一种相对分子量(Mr)为50581的细胞外蛋白质。其作为创伤弧菌向胞外释放的唯一细胞毒素,由大多数致病菌株产生,具有水溶性,对热不稳定。近年来,创伤弧菌溶细胞毒素作为创伤弧菌致病中的关键性因子,越来越引起研究者的关注。在以往的研究中,本课题组利用基因工程技术成功构建了表达载体pET32a-(+)-vvhA,并对其表达、纯化和复性条件进行了优化,从而得到了获得了较高纯度和浓度的创伤弧菌溶细胞毒素。为创伤弧菌溶细胞毒素生物学活性的深入研究奠定基础,并发现创伤弧菌溶细胞毒素可独立发挥作用对机体肺组织造成损伤；在研究创伤弧菌致病机制过程中本课题组还发现创伤弧菌溶细胞毒素能够以诱导凋亡的方式杀伤人脐静脉内皮细胞株HU细胞。另据文献报道创伤弧菌溶细胞毒素对多种哺乳动物细胞有着极强的杀伤作用,其杀伤作用的方式包括引发细胞发生渗透性溶解和诱导细胞发生凋亡。那么其对肿瘤细胞是否具有杀伤作用?杀伤方式又如何?目前尚未见相关文献报道。基于创伤弧菌溶细胞毒素对多种哺乳动物细胞的杀伤作用及本课题组的前期研究基础,我们进行了本项研究,旨在探讨创伤弧菌溶细胞毒素对人肺腺癌细胞株A549的杀伤作用及初步的分子机制。本研究首先利用本课题组前期构建的表达载体pET32a-(+)-vvhA,在最佳诱导条件下获得足量、高纯度的创伤弧菌溶细胞毒素,在此基础上探讨创伤弧菌溶细胞毒素对肺腺癌细胞株A549生物学特性的影响,并重点探讨了创伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞的杀伤作用,确定了创伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞杀伤作用的剂量范围、时间范围、作用方式以及关键因素,初步阐明了创伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞杀伤作用的分子机制,为进一步揭示创伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞杀伤作用机制奠定了基础。方法1.创伤弧菌溶细胞毒素的表达、纯化和鉴定重组大肠杆菌pET-32a-whA/E.coliBL21(DE3)’恢复培养,小量表达；挑取转化重组的单菌落进行PCR扩增并琼脂糖电泳验证目的基因存在。挑选单菌落并以最佳诱导条件进行诱导培养,离心收集细菌,超声破菌,离心后上清液经过His-Bind亲和层析方法纯化重组创伤弧菌溶细胞毒素(rVVC)并行SDS-PAGE电泳及Western-blot验证。纯化后的蛋白以透析法进行复性和浓缩。采用BCA (bicinchoninic acid)法进行蛋白定量,绘制标准曲线,计算出蛋白浓度。2.创伤弧菌溶细胞毒素对人肺腺癌细胞株A549以及人永生化支气管上皮细胞株HBE的灭杀作用2.1创伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞株体外增殖能力的影响和灭杀作用；(1)利用MTT法检测创伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞株体外增殖能力的影响；(2)台盼蓝染色检测伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞株体外灭杀作用；(3)平板克隆形成实验检测伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞株体外克隆形成能力的影响；(4)利用细胞爬片,常规HE染色观察创伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞株形态结构的影响；利用透射电镜观察创伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞株超微结构的影响；(5)利用生物体视学的原理和方法对经创伤弧菌溶细胞毒素处理前后的A549细胞的面积、周长、长轴、短轴,细胞核的面积、周长、长轴和短轴进行测量,并计算细胞及细胞核的形状因子PE、AR、RFF、FII以及细胞的胞浆面积、核浆比；为研究创伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞重要细胞器(线粒体)的超微形态结构的影响,对经创伤弧菌溶细胞毒素处理前后的A549细胞的线粒体超微形态结构进行了体视学研究,透射电镜下(6200倍)测量处理前后A549细胞线粒体的面积、周长、长轴、短轴,计算线粒体的体积密度、表面积密度、数密度、平均体积和平均表面积。2.2创伤弧菌溶细胞毒素对HBE细胞株体外增殖能力的影响和灭杀作用；(1)利用MTT法检测创伤弧菌溶细胞毒素对HBE细胞株体外增殖能力的影响；(2)台盼蓝染色检测伤弧菌溶细胞毒素对HBE细胞株体外灭杀作用；(3)平板克隆形成实验检测伤弧茵溶细胞毒素对HBE细胞株体外克隆形成能力的影响；3.创伤弧菌溶细胞毒素对肺腺癌细胞株杀伤作用的机制利用二硝基苯肼比色法检测创伤弧菌溶细胞毒素作用不同时间后A549细胞培基中乳酸脱氢酶活性的变化；利用Hochest333258荧光染色及透射电镜观察A549细胞凋亡变化；流式细胞仪检测不同浓度创伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞株凋亡率的影响：琼脂糖凝胶电泳观察A549细胞凋亡DNA Ladder的产生；利用Westen Blot检测创伤弧菌溶细胞毒素对A549 Bcl-2、Bax蛋白表达的影响。结果1.创伤弧菌溶细胞毒素的表达、纯化、鉴定创伤弧菌溶细胞毒素小量表达成功,在凝胶上70KD的位置可见相应的蛋白条带(创伤弧菌溶细胞毒素分子量约为50KD,载体蛋白约为20KD)；挑取单菌落培养,进行质粒提取,并以其为模板进行PCR扩增whA基因,琼脂糖电泳获得相应大小目的条带(whA:1356bp)。SDS-PAGE电泳显示阳性克隆重组大肠杆菌pET-32a-vvhA/E.coliBL21 (DE3)经IPTG诱导培养,能表达融合蛋白rVVC,在凝胶上70KD的位置可见相应蛋白条带。rVVC经透析复性、浓缩后,BCA法测定蛋白浓度为1.163mg/ml。Western-blot免疫印迹实验结果表明表达产物rVVC能与抗6×His组氨酸单克隆抗体特异结合。2.创伤弧菌溶细胞毒素对肺腺癌细胞株A549以及人永生化支气管上皮细胞株HBE的灭杀作用2.1创伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞株体外增殖能力的影响和灭杀作用(1)MTT法检测创伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞株体外增殖能力的影响MTT法对不同浓度创伤弧菌溶细胞毒素处理过的A549细胞生长曲线以及吸光率的测定,5μg/ml组、10μg/ml组、15μg/ml组、20μg/ml组、25μg/ml、30μg/ ml组细胞24h增殖抑制率分别为：(30.96±2.94)%,(36.53±4.49)%,(45.97±4.21)%,(57.67±4.91)%,(61.72±5.75)%,(71.06±8.05)%；48h增殖抑制率分别为：(36.76±2.93)%,(40.59±5.12)%,(60.857.32)%,(66.32±6.46)%,(72.95±8.49)%,(79.65±8.28)%；72h增殖抑制率分别为：(39.14±3.89)%,(43.04±4.77)%,(61.01±5.52)%,(68.06±5.65)%,(75.68±8.16)%,(82.55±8.25)%。析因分析结果表明：不同浓度的rVVC对细胞增殖的影响差异有统计学意义(F=67.142, P=0.000); rVVC处理不同的时间对A549细胞增殖的影响差异也有统计学意义(F=16.203,P=0.000)；不同时间及不同浓度组间不存在交互效应(F=0.356,P=0.957)；说明：rVVC抑制A549细胞的增殖与作用时间和作用浓度有关。(2)台盼蓝染色检测伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞株体外灭杀作用台盼蓝拒染法检测不同浓度创伤弧菌溶细胞毒素处理后的7组A549细胞的即刻、24 h和48 h灭杀率,即刻灭杀率分别为0.00%、1.44%、2.91%、2.57%、3.35%、5.59%、5.73%,不同处理组的即刻灭杀率差异有统计学意义(F=7.023,P=0.003)；24 h细胞灭杀率分别为0.01%、21.74%、31.26%、41.31%、43.44%、51.67%、62.98%不同处理组的24h灭杀率差异有统计学意义(F=33.525,=0.000)；48 h灭杀率分别为0.08%、31.05%、50.99%、56.90%、64.99%、55.77%、56.89%不同处理组的48h灭杀率差异有统计学意义(F=25.136P=0.000)。(3)平板克隆形成实验检测伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞株体外克隆形成能力的影响平板克隆形成实验中对照组克隆形成率为68.40%,实验组为44.20%,比Control组下降35.38%,两组细胞克隆形成率差异具有统计学意义(x2=178.526,p=0.000)。(4)创伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞株形态结构及超微结构的影响HE染色倒置显微镜观察空白对照组细胞,生长状态良好,胞浆丰富淡染,胞核近似于圆形或卵圆形,核仁清晰；而实验组A549细胞形态发生明显改变：细胞生长稀疏,胞浆稀少深染,细胞核变得细长,部分细胞胞核固缩；电镜观察空白对照组细胞：体积较大,形态近似于圆形或椭圆形,胞浆丰富,可见线粒体等细胞器,并可见明显的核分裂,而实验组A549细胞表面微绒毛变少,胞质深,核染色质凝聚,有的细胞,大部分核染色质凝聚呈一个或数个块状,占据核中部；有的细胞核染色质完全凝聚、占满整个核区,有的细胞和染色质凝集,形成明显的凋亡小体；部分细胞肿胀坏死,胞浆溶解,仅见胞核。(5)创伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞株形态结构及超微结构影响的体视学研究空白组和10μg/ml创伤弧菌溶细胞毒素(VVC)攻击组A549细胞的参数值分别为：空白对照组：细胞核的面积(μm2),为(157.807±45.611)；细胞核周长(μm),为(55.381±10.833)；细胞面积(μm2),为(363.209±119.538)；细胞周长(μm),为(104.317±21.988)；胞浆面积(μm2),为(204.873±108.116)；核浆比为(1.0476±0.7029)。10μg/ml创伤弧菌溶细胞毒素(VVC)攻击组细胞核的面积(μm2),为(102.390±31.962)；细胞核周长(μm)为(49.764±9.003)；细胞面积(μm2)为(219.910±70.00)；为细胞周长(μm),为(89.622±22.025)；胞浆面积(μm2),为(117.528±50.988)；核浆比为(1.5103±4.6697)。空白组和10μg/ml创伤弧菌溶细胞毒素(VVC)攻击组细胞透射电镜6200倍观察线粒体的参数值分别为：空白对照组：体积密度为(0.1635±0.0762)、表面积密度(μm2/3)为(0.1334±0.0526)、平均体积(μm3)为(2.8332±1.2543)、数密度(μm-3)为(0.0599±0.0216)、平均表面积(μm3)为(2.2755±0.6560)10μg/ml创伤弧菌溶细胞毒素(VVC)攻击组：体积密度为(0.1010±0.1837)、表面积密度(μm2/3)为(0.8941±1.4719)、平均体积(μm3)为(1.0498±2.4099)、数密度(μm-3)为(0.3949±0.3338)、平均表面积(μm3)为(6.1017±19.9348)。2.2创伤弧菌溶细胞毒素对HBE细胞株体外增殖能力的影响和灭杀作用(1)MTT法检测创伤弧菌溶细胞毒素对HBE细胞株体外增殖能力的影响MTT法对不同浓度创伤弧菌溶细胞毒素处理过的HBE细胞生长曲线以及吸光率的测定,0.625μg/ml组、1.25μg/ml组、2.5μg/ml组、5μg/ml、10μg/ml组细胞24h增殖抑制率分别为：(14.80±2.55)%,(23.65±1.27)%,(26.38±2.12)%,(40.99±3.19)%,(48.90±7.77)%；48h增殖抑制率分别为：(24.66±1.46)%,(42.05±6.66)%,(45.45±8.80)%,(59.87±5.08)%,(70.84±10.72)%：72h增殖抑制率分别为：(34.14±3.84)%,(49.30±8.39)%,(55.18±3.99)%,(72.08±6.22)%；(77.77±7.04)%。析因分析结果表明,不同浓度的rVVC对细胞增殖的影响差异有统计学意义(F=58.810, P=0.000); rVVC处理不同的时间对HBE细胞增殖的影响差异也有统计学意义(F=68.299,P=0.000)；不同时间及不同浓度组间不存在交互效应(F=0.570,P=0.794)。研究结果说明rVVC以时间和剂量依赖的方式抑制HBE细胞增殖。(2)台盼蓝染色实验检测伤弧菌溶细胞毒素对HBE细胞株体外灭杀作用台盼蓝拒染法检测不同浓度创伤弧菌溶细胞毒素处理后的6组HBE细胞的即刻灭杀率、24h和48h灭杀率,即刻灭杀率分别为0.00%、1.30%、1.64%、2.16%、2.61%、4.86%,不同处理组的即刻灭杀率差异有统计学意义(F=14.932,P=0.003)；24h细胞灭杀率分别为0.00%、12.39%、19.42%、27.69%、40.85%、52.65%,不同处理组的24h灭杀率差异有统计学意义(F=98.395,P=0.000)；48h灭杀率分别为0.1%、22.03%、47.96%、55.31%、63.52%、77.48%,不同处理组的48h灭杀率差异有统计学意义(F=52.615,P=0.000)。(3)平板克隆形成实验检测检测伤弧菌溶细胞毒素对HBE细胞株体外克隆形成能力的影响平板克隆形成实验中对照组克隆形成率为47.40%,实验组为29.10%,比Control组下降38.60%,两组细胞克隆形成率差异具有统计学意义(x2=106.745,p=0.000)；3.创伤弧菌溶细胞毒素对肺腺癌细胞株杀伤作用的机制二硝基苯肼比色法检测10μg/ml rVVC处理不同时间的A549细胞培基中乳酸脱氢酶活性无明显变化,各组见乳酸脱氢酶活性分别为：Oh组：155.60±5.35U/L；0.5h组151.6-3.52 U/L；2h组156.68±7.70 U/L；4h组159.51±4.23 U/L；8h组157.83±2.23 U/L。Hoechest 333258荧光染色观察A549细胞核,空白对照组A549细胞胞核呈均匀的蓝色荧光,加入10μg/ml rVVC 24h后,出现凋亡细胞,凋亡细胞呈圆形或椭圆形的高亮蓝色荧光,可见明显的染色质凝集；透射电镜观察发现10μg/ml rVVC处理24h后,细胞呈现明显的凋亡形态改变如异染色质增多、染色质边集、凋亡小体形成等；流式细胞仪测定不同浓度rVVC对A549细胞凋亡的影响,随着创伤弧菌溶细胞毒素浓度的增加细胞凋亡率逐渐上升；琼脂糖凝胶电泳图中可见典型的DNA-Ladder条带形成；Western blot分析表明Bcl-2蛋白表达水平轻微下降,而Bax蛋白表达去明显上升,从而导致二者比率明显下降。结论1.创伤弧菌溶细胞毒素具有灭杀人肺腺癌细胞株A549和人永生化支气管上皮细胞株HBE的作用,其灭杀效果与作用时间和作用浓度有关；对A549细胞24小时半数致死剂量IC50为8.540μg/ml,并且用接近ICs0的创伤弧菌溶细胞毒素作用A549细胞,12小时即可产生杀伤作用,在48小时内随着作用时间的延长杀伤作用逐渐增强,48小时达到杀伤峰值,可维持至120小时左右。创伤弧菌溶细胞毒素可以影响人肺腺癌细胞株A549的形态结构；创伤弧菌溶细胞毒素可以损伤人肺腺癌细胞株A549线粒体的超微结构,使A549细胞株的能量代谢的结构基础受到损伤；2.创伤弧菌溶细胞毒素对A549细胞株的杀伤作用主要是诱导细胞发生凋亡,其机制与A549细胞的线粒体损伤,细胞能量代谢的结构基础受到损伤有关,与Bcl-2蛋白表达增加和Bax蛋白表达下降有关。本研究的创新之处1.首次证明了创伤弧菌溶细胞毒素对肺腺癌细胞株A549具有明显的杀伤作用。2.首次利用生物体视学的原理和方法对创伤弧菌溶细胞毒素对肺腺癌细胞株A549形态结构及超微结构的损伤进行了分析,从定量角度及超微结构水平揭示了创伤弧菌溶细胞毒素对肺腺癌细胞株A549杀伤作用的机制。3.首次证实创伤弧菌溶细胞毒素对肺腺癌细胞株A549的杀伤作用主要是损伤线粒体并诱导细胞凋亡来实现的,其机制与损伤A549细胞的线粒体,使细胞的能量代谢的结构基础受到影响,并促使Bcl-2蛋白表达增加和Bax蛋白表达减少。