支气管哮喘是一种以气道慢性炎症、平滑肌功能紊乱和气道重塑为主要病理改变的气道炎症性疾病。其中气道重塑是导致支气管哮喘患者不可逆性气流受限、肺功能受损的病理基础。气道重塑的病理表现主要包括上皮结构与功能的改变、微血管的重构、平滑肌异常增生与肥大、基底膜增厚、细胞外基质沉积等。其中气道上皮的改变主要表现为对不同刺激因子的易感性增强及损伤后上皮的异常修复。气道上皮在损伤修复中会产生多种促炎因子,如白细胞介素-33(IL-33)、白细胞介素-25(IL-25)、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)等,其中IL-33是气道上皮损伤后释放,诱导气道炎症的重要因子。白细胞介素-33广泛表达于多种组织中,IL-33可由多种结构细胞如成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞及上皮细胞等和炎性细胞产生。但在不同种类的细胞IL-33的表达水平差异很大。相对而言,IL-33更多是由与外界相通的黏膜系如呼吸道、消化道等产生。有研究发现,IL-33具有双重作用:一方面,IL-33位于细胞核内,在转录调控中起作用;另一方面IL-33作为细胞因子可被分泌到细胞外,通过与其特异性受体ST2(ST2为IL-33的特异性受体,属于IL-1受体家族的成员,IL-33通过与ST2结合启动细胞膜表面IL-33/ST2信号传导通路发挥生物活性)结合并相互作用发挥其细胞因子的作用。IL-33与其受体ST2的相互作用参与了机体多种疾病的生物学活性,其中包括促进支气管哮喘炎症过程中的Th2反应。近年来越来越多的研究表明IL-33在支气管哮喘气道重塑这一病理改变的发生发展过程中有及其重要的作用,其可通过诱导纤维细胞活化并产生白细胞介素-13(IL-13)、白细胞介素-5(IL-5),进而在哮喘气道炎症反应中起重要作用。有研究表明IL-33/ST2轴可通过对肥大细胞、气道上皮细胞、平滑肌细胞、Th2等细胞产生作用,进而参与哮喘的发生、发展。近期的研究还证实IL-33在无外源性抗原刺激时促进固有免疫细胞产生IL-5,IL-13等,而IL-13可促进成纤维细胞的增殖和活化,增强平滑肌细胞的收缩力,进而在哮喘气道重塑中起重要作用。我们既往有研究发现IL-33可通过IL-33/ST2信号通路促进哮喘气道重塑。同时有研究证实IL-33/ST2活化后可通过下游的NF-κB和MAPK信号通路,促进Th2细胞因子的产生,进而参与多种疾病如过敏性休克、特应性皮炎、类风湿关节炎、自身免疫疾病等的发生和发展过程。越来越多的研究发现,IL-33介导了支气管哮喘发病机制的许多环节,有望为支气管哮喘的个体化治疗提供一个新靶点。纤维细胞是一类独特的骨髓间充质祖细胞,其特征是特异性表达造血细胞标记物(CD34、CD45和白细胞特异性蛋白1)和基质细胞标记物(I型胶原和脯氨酸-4-羟化酶)。其最初在外周血单个核细胞(PBMCs)中分离出来,并在损伤修复中作为CD45+CD45RO+CD34+CD11b+CD13+HLA-DR+细胞,这些细胞在TGF-β1刺激下产生纤维蛋白和胶原,并表达成肌细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白。越来越多的证据表明,纤维细胞是循环间充质祖细胞,作为成纤维细胞和成肌细胞的可再生来源,在组织损伤修复与慢性炎症中至关重要。其是参与巨噬细胞促炎特性和成纤维细胞组织重塑特性的一类独特的细胞,在人类很多疾病的特异性炎症反应中起重要作用。因其可特异性表达CD34和I型胶原而与成纤维细胞和巨噬细胞等相关细胞区别。有研究发现纤维细胞的数量与上皮下基底膜的厚度呈明显正相关,提示纤维细胞与哮喘气道重塑密切相关,现已有研究证实纤维细胞在一些模型中能够促进α-平滑肌肌动蛋白的表达而在组织重塑中起重要作用。还有研究发现循环中的纤维细胞可能是通过在气道上皮下聚集而引起气道平滑肌增生肥厚,并可分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)进而促进哮喘气道重塑。尤其是最近的研究发现哮喘患者外周血来源的纤维细胞与IL-17A作用可产生促炎细胞介质,还可以与Th2型细胞因子作用产生胶原。故纤维细胞在介导支气管哮喘的发生、发展中发挥重要作用。体外培养外周血单个核细胞加入血小板源性生长因子可产生纤维细胞,用IL-33刺激后纤维细胞表达增加。IL-33在不增加内源性转化生长因子β1产生的情况下,增强了纤维细胞的增殖及表达α-SMA增多。IL-33刺激后纤维细胞组成性地表达IL-13和IL-5增加。还有研究发现IL-33能促进过敏性哮喘患者循环中纤维细胞的迁移和增殖。但IL-33活化的纤维细胞与气道重塑的相互作用及机制尚不清楚。迄今为止,国内外研究表明气道上皮细胞和纤维细胞均在支气管哮喘的发生发展中起重要作用,而IL-33在哮喘相关的气道炎症中有至关重要的作用。但是有关气道上皮与纤维细胞之间的相互作用,IL-33对哮喘气道重塑的影响以及IL-33如何通过纤维细胞进而对气道重塑产生影响的研究证据尚不充足。研究目的:1.探讨IL-33/ST2-p38MAPK信号通路可通过增强纤维细胞的促纤维化作用进而促进哮喘气道重塑。2.通过体外培养纤维细胞,对IL-33/ST2-p38MAPK信号通路进行干预,进而研究该信号通路对哮喘气道重塑标志物的影响。3.通过建立小鼠哮喘模型,采用ST2的抗体或者p38 MAPK的特异性拮抗剂(SB203580)干预,在体内实验中观察IL-33/ST2-p38MAPK信号通路可通过诱导纤维细胞增殖进而参与哮喘气道重塑。研究方法:1.从32例支气管哮喘患者和30例对照组患者(纤维支气管镜活检)分别获取肺组织标本,应用苏木精-伊红染色法(HE)以观察哮喘患者气道重塑相关的病理学表现,采用免疫组织化学染色法(IHC)观察IL-33及气道重塑标记物I型胶原(Collagen Ⅰ)、纤维连接蛋白-1(FN1)与α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)在各组患者肺组织中的表达情况。2.ELISA法检测哮喘患者及对照组患者中外周血IL-33的表达水平,应用流式细胞学检测两组患者外周血单个核细胞中纤维细胞的比例,并对外周血IL-33的表达水平与纤维细胞的比例行相关性分析。3.体外培养纤维细胞,加入IL-33刺激细胞,采用Western blot和qPCR方法检测细胞中I型胶原、纤维连接蛋白-1(FN1)及α-SMA的表达水平,应用流式细胞学检测IL-33对纤维细胞增殖的影响。4.体外培养纤维细胞,应用ST2的抗体和(或)p38 MAPK的抑制剂(SB203580)预处理纤维细胞,再加入IL-33刺激细胞,采用Western blot和qPCR方法观察纤维细胞中I型胶原、FN1及α-SMA和ST2的表达水平,应用流式细胞学检测抑制IL-33/ST2-p38MAPK信号通路后对纤维细胞增殖的影响。5.建立小鼠哮喘动物模型,采用IHC观察小鼠气道上皮中IL-33、Collagen I、FN1、α-SMA的表达情况。给予ST2抗体和(或)SB203580预处理后,应用IHC、Western blot和qPCR的方法检测抑制IL-33/ST2-p38MAPK信号通路后对小鼠哮喘气道重塑的影响,同时应用流式细胞学检测抑制IL-33/ST2-p38MAPK信号通路后对纤维细胞增殖的影响。研究结果:1.通过比较哮喘患者和对照组患者的肺组织HE染色,发现哮喘患者的气道上皮具有明显的与气道重塑相关的病理学表现,如:基底膜增厚、气道上皮细胞化生与脱落,炎性细胞浸润,胶原沉积等。同时进行IHC染色,发现哮喘患者气道组织中IL-33、Ⅰ型胶原、FN1及α-SMA的表达较对照组明显增加。2.与对照组比较,哮喘患者外周血IL-33的水平及外周血单个核细胞中的纤维细胞的比例均增加,相关性分析显示两者呈明显正相关。3.体外培养的纤维细胞应用IL-33处理后,其细胞中Ⅰ型胶原、FN1及α-SMA的表达均显著增加,同时可促进纤维细胞增殖。4.体外培养纤维细胞,应用ST2的抗体和(或)SB203580预处理后,其细胞中Ⅰ型胶原、FN1及α-SMA和ST2的表达水平较对照组明显降低,纤维细胞的数目也明显降低。5.在小鼠哮喘动物模型中,HE染色显示气道上皮杯状细胞增多,气道上皮平滑肌增生,基底膜增厚,应用ST2抗体和(或)SB203580预处理的小鼠哮喘模型则上述表现减弱。通过IHC染色发现小鼠肺组织中IL-33、Ⅰ型胶原、FN1及α-SMA的表达较对照组明显增加,肺泡灌洗液中纤维细胞的数目较对照组增加。应用ST2抗体和(或)SB203580预处理后,IHC提示哮喘气道重塑的病理学改变如基底膜增厚是减轻的,且气道上皮表达IL-33,Ⅰ型胶原、FN1及α-SMA亦减少,流式细胞学提示纤维细胞数量也是明显降低的。研究结论:1.哮喘患者气道上皮细胞分泌的IL-33增加,可通过与纤维细胞表面的特异性受体结合,通过p38 MAPK信号通路,引起纤维细胞中Ⅰ型胶原、FN1及α-SMA的表达增加,进而导致哮喘气道重塑的加剧。2.通过体内及体外抑制IL-33/ST2-p38MAPK信号通路,可降低纤维细胞中气道重塑标志物的表达,并改善实验动物的气道重塑的相关表现。3.IL-33可通过ST2-p38MAPK信号通路诱导纤维细胞活化进而促进哮喘气道重塑,提示IL-33/ST2-p38MAPK信号通路可能成为支气管哮喘治疗的一个新的有效靶点。