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研究背景和目的肾间质纤维化是以间质细胞外基质沉积、肾小管萎缩和炎性细胞浸润等为主要病理改变的肾脏病变,是多种慢性肾脏疾病进展至终末期肾脏病的主要结局。肾小管上皮细胞(Tubular epithelial cells,TECs)在肾间质纤维化发生发展中发挥重要作用。近期研究发现,肾纤维化过程中存在TECs自噬的过度活化,但其具体作用仍有争议。此外,自噬介导肾纤维化的分子机制还不明确。JNK连接蛋白(JNK-interacting protein,JIPs)是 JNK 或 p38 MAPK 信号通路中的一类支架蛋白,其家族成员有JIP1、JIP2、JIP3、JIP4和JNK-亮氨酸拉链相关蛋白(JNK-associated leucine-zipper protein,JLP)。新近研究表明,JLP 可在大脑浦肯野纤维细胞中负性调控自噬发生。本课题组前期实验发现,JLP高表达于TECs,JLP敲除小鼠在单侧输尿管结扎(Unilateral ureteral obstruction,UUO)后所致的肾纤维化反应较野生型小鼠明显增高,提示JLP在肾纤维化中发挥一定作用。结合目前研究现状和本课题组前期实验基础,我们推测JLP可能通过调控自噬水平来干预肾纤维化发生发展。本研究使用jlp敲除小鼠为实验对象,通过构建UUO模型观察jlp基因缺失对UUO所致肾纤维化及自噬活性的影响;体外培养人TECs细胞系HK-2,探索JLP介导自噬改变的分子机制。本研究旨在前期研究的基础上,进一步探讨支架蛋白JLP在肾纤维化中的作用和分子机制。为临床防治肾纤维化提供新的理论依据及治疗靶点。方法第一部分:动物分组:(1)野生型小鼠+假手术组;(2)野生型小鼠+UUO模型组;(3)jlp基因敲除小鼠+假手术组;(4)jlp基因敲除小鼠+UUO模型组。免疫荧光检测JLP在小鼠肾脏组织的分布和固有细胞的共定位;免疫荧光、免疫组化、蛋白印迹和real-time PCR观察各组JLP表达改变;免疫荧光、免疫组化和real-time PCR检测CKD各期患者JLP表达改变;HE染色和Masson染色观察各组小鼠肾脏组织病理形态和胶原沉积;免疫荧光、免疫组化、蛋白印迹和real-time PCR观察各组α-SMA、纤连蛋白(Fibronectin,FN)和Collagen-Ⅰ的表达改变。免疫组化和免疫荧光检测各组肾脏组织F4/80细胞表达和caspase-3蛋白表达;免疫荧光、蛋白印迹和 real-time PCR 检测转化生长因子(Transforming growth factor beta,TGF-β)表达及 Smad 信号通路活化。细胞分组:(1)Scramble siRNA+Medium 组;(2)Scramble siRNA+TGF-β刺激组;(3)jlpsiRNA+Medium 组;(4)jlpsiRNA+TGF-β组。免疫荧光和蛋白印迹观察各组α-SMA、FN和Collagen-Ⅰ的表达改变;流式细胞术检测各组细胞周期和凋亡改变。第二部分:动物分组:(1)野生型小鼠+假手术组;(2)野生型小鼠+UUO模型组;(3)jlp基因敲除小鼠+假手术组;(4)jlp基因敲除小鼠+UUO模型组。免疫印迹检测各组小鼠肾脏组织LC3和Beclin-1蛋白表达;免疫荧光检测各组小鼠肾脏组织LC3荧光表达;透射电镜检测各组肾脏TECs自噬体数目改变。细胞分组:(1)饥饿处理Scramble siRNA或jlp siRNA干扰的HK-2细胞;(2)自噬抑制剂巴弗洛霉素 A1(Bafilomycin A1,Baf A1)处理 Scramble siRNA 或 jlp siRNA 干扰的 HK-2 细胞;(3)TGF-β处理Scramble siRNA或jlp siRNA干扰的HK-2细胞;处理完毕后Western-blotting法检测各组LC3、Beclin-1和SQSTM1表达改变情况。(4)转染mRFP-GFP-LC3质粒于RNA或jlp siRNA干扰的HK-2细胞;收集细胞前饥饿处理4 h,免疫荧光观察各组RFP荧光、GFP荧光分布及表达改变。第三部分:动物分组:(1)野生型小鼠+假手术+生理盐水组;(2)野生型小鼠+UUO模型+生理盐水组;(3)jlp基因敲除小鼠+假手术+生理盐水组;(4)jlp基因敲除小鼠+UUO模型+生理盐水组;(5)野生型小鼠+假手术+氯喹组;(6)野生型小鼠+UUO模型+氯喹组;(7)jlp基因敲除小鼠+假手术+氯喹组;(8)jlp基因敲除小鼠+UUO模型+氯喹组。Masson染色观察各组小鼠肾脏组织胶原沉积情况;蛋白印迹检测各组LC3、SQSTM1和α-SMA的表达改变。细胞分组:(1)scramble siRNA+medium 组;(2)scramble siRNA+medium+Baf A1 组;(3)scramble siRNA+TGF-β+medium 组;(4)scramble siRNA+TGF-β+Baf A1 组;(5)jlp siRNA+medium 组;(6)jlp siRNA+medium+Baf A1 组;(7)jlp siRNA+TGF-β+medium;(8)jlp siRNA+TGF-β+Baf A1。蛋白印迹检测各组 LC3、SQSTM1和α-SMA的表达改变。结果第一部分:JLP在小鼠肾脏组织中主要表达于TECs,近端小管表达稍高于远端小管,在肾小球及肾脏固有成纤维细胞表达微弱。JLP表达随着肾功能降低逐渐减少,且具有统计学差异(p<0.05);jlp敲除小鼠其UUO所致肾脏病理形态和胶原沉积情况均较野生型明显加重;且肾脏α-SMA、FN和Collagen-Ⅰ的表达也较野生型小鼠明显升高。细胞增殖、细胞凋亡和巨噬细胞浸润程度在jlp敲除小鼠中均有明显加重。进一步研究表明,jlp敲除小鼠存在TGF-β表达上调及Smad信号通路明显的过度活化。体外细胞实验部分验证了上述结果。第二部分:Western-blotting、免疫荧光和透射电镜结果均证实,jlp敲除小鼠在接受UUO造模后其肾脏自噬水平较野生型明显升高,差异具有统计学意义(p<0.05)。饥饿、Baf A1和TGF-β处理jlp siRNA组HK-2的LC3-Ⅱ表达水平明显高于scramble siRNA组,差异具有统计学意义(p<0.05)。mRFP-GFP-LC3质粒实验表明,饥饿诱导jlp siRNA组细胞mRFP+GFP-和mRFP+GFP+颗粒数目显著大于scramble siRNA组,具有统计学差异(p<0.05)。第三部分:给予自噬抑制剂氯喹处理可明显抑制UUO所致肾纤维化反应,表现为肾脏胶原纤维沉积较生理盐水处理组明显减弱,且肾脏α-SMA表达水平明显降低;与此同时,JLP缺失加重的肾纤维化反应也可被氯喹所抑制。体外给予Baf A1处理同样可以降低TGF-β诱导的纤维化表型,下调JLP表达导致的加重纤维化表型可进一步给Baf A1所抑制。结论JLP主要表达于TECs,jlp敲除小鼠可加重UUO所致肾纤维化反应,并使UUO所致自噬过度活化;体外细胞研究表明JLP可在自噬起始阶段调控自噬;氯喹处理UUO造模小鼠可明显改善其纤维化反应,提示jlp敲除小鼠存在的过度自噬可能是诱导其加重肾纤维化反应的机制。本研究首次发现JLP可通过调控自噬水平介导肾纤维化反应,为未来临床防治肾纤维化提供新的潜在治疗靶点。