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随着生活水平的不断提高,肥胖人群的数量越来越多,糖尿病的发病率逐年提高,已成为严重威胁人类健康的主要疾病之一,2型糖尿病占整个糖尿病的97%以上。2型糖尿病的主要特征是胰岛素抵抗和胰岛细胞功能损伤。近年研究发现肥胖患者和2型糖尿病患者中存在脂代谢紊乱,体内游离脂肪酸(free fatty acids,FFAs)水平明显高于正常人,提示游离脂肪酸在2型糖尿病的发生、发展中起重要作用。研究发现高游离脂肪酸增加细胞内活性氧化物质(reactive oxygen species,ROS),导致胰岛细胞功能损伤。细胞内ROS的增加会引起DNA链断裂、损伤,进而激活聚(ADP-核糖)聚合酶(Poly(ADP-ribose)polymerase,PARP)。PARP的过度激活消耗细胞内NAD+/ATP,造成细胞内能量耗竭,细胞坏死。PARP-1抑制剂烟酰胺和3-氨基苯酰胺(3-aminobenzamide3-AB)已运用于Ⅰ型糖尿病治疗模型中,并取得了一定的成功。PJ34长期用于糖尿病视网膜病变的动物试验中,也已证实取得良好疗效。而关于PARP-1抑制剂在2型糖尿病治疗中的作用国内外仍未见研究。本课题选择两种常见的PARP-1抑制剂:低效能的PARP-1抑制剂3-氨基苯酰胺和高效能的PARP-1抑制剂PJ34。用来研究PARP-1抑制剂在FFAs诱导胰岛细胞凋亡中的作用,进一步探讨2型糖尿病的脂毒性发病机制,为2型糖尿病的治疗提供新思路。本课题拟通过观察PARP抑制剂在FFAs诱导胰岛β细胞功能衰竭及凋亡中的作用,为PARP-1抑制剂运用于2型糖尿病治疗提供理论依据。
本实验培养能分泌胰岛素的RIN-m5F胰岛细胞株,以PA(0.25 mmol/L)、OA(0.25 mmol/L)及PARP-1抑制剂(3-AB和PJ34)分别作用RIN-m5F胰岛细胞,采用MTT法检测细胞增殖活力,选择合适的PARP-1抑制剂浓度及实验处理时间,放射免疫法检测各实验组RIN-m5F胰岛细胞培养液中葡萄糖刺激下的胰岛素分泌量;采用RT-PCR及Western-blot方法检测胰岛细胞畔WARP-1及凋亡相关基因的表达;同时采用流式细胞术及TUNEL方法观察胰岛细胞凋亡。
实验结果表明在饱和游离脂肪酸软脂酸(paimitic acid,PA)的单独作用下,随着时间的延长,细胞活力及胰岛素分泌功能明显降低(P<0.01),不饱和脂肪酸(oleic acids,OA)对细胞的增殖活力和胰岛素分泌功能无明显影响(P>0.05),且PA+OA组细胞的增殖活力和胰岛素分泌能力较PA组明显升高(P<0.01,P<0.01);在PA诱导胰岛细胞凋亡的过程中,PARP-1及Bax表达显著性升高(P<0.01,P<0.05),而Bcl-2表达无显著性变化(P>0.05);低效能的PARP-1抑制剂3-氨基苯酰胺(3-Aminobenzamide,3-AB)与PA共同处理细胞后,细胞的增殖活力及胰岛素分泌水平与PA组比较明显升高(P<0.05,P<0.01),且Bax的表达较PA组明显降低(P<0.05),胰岛细胞凋亡显著降低(P<0.01);高效能的PARP-1抑制剂PJ34与PA共同孵育后,胰岛细胞的增殖活力和胰岛素分泌水平较PA单独处理无显著性差异(P>0.05,P>0.05),Bax的表达明显降低(P<0.05),而细胞凋亡水平无显著性差异(P>0.05)。
结论:
1.游离脂肪酸对RIN-m5F胰岛细胞的增殖活力及胰岛素分泌功能有一定的影响,影响程度与FFAs的种类有关。表现为饱和脂肪酸PA明显抑制胰岛细胞的增殖活力和胰岛素分泌能力,且诱导了RIN-m5F胰岛细胞凋亡;而不饱和脂肪酸OA对RINm5F胰岛细胞功能和生存无显著性抑制作用,且不饱和脂肪酸OA在适合条件下能抑制PA所诱导的RINm5F胰岛细胞功能衰竭,此可为2型糖尿病的脂毒性发病机制提供理论依据。
2.低效能的PARP-1抑制剂3-AB可能通过调节Bel-2/Bax的表达而有效抑制饱和脂肪酸PA所诱导的RIN-m5F胰岛细胞功能损伤和细胞凋亡,此可为PARP-1抑制剂应用于2型糖尿病的治疗提供理论依据。
3.高效能的PARP抑制剂PJ34对饱和脂肪酸PA所诱导的胰岛细胞功能损伤和细胞凋亡无显著性作用,提示运用高效能的PARP-1抑制剂治疗2型糖尿病,还有待更深入的研究和探讨。