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骨折愈合是一个复杂有序的过程,涉及诸多生物因子,如肽能神经递质。降钙素基因相关肽(Calcitonin gene-related peptide,CGRP)是一种在机体多个组织器官内表达最广泛的神经多肽,已被证实具有促进骨折后重塑的生物学功能,它的受体复合物包括:降钙素受体样受体(Calcitonin receptor like receptor,CRLR)、受体活性修饰蛋白(Receptor activity modifying protein,RAMP)、受体组分蛋白(Receptor component protein,RCP)[1]。早在1987年就有研究报道,骨折合并中枢神经系统损伤的患者,愈合时间比正常短;而合并周围神经系统损伤的患者,愈合时间明显延长[2]。之后的研究发现,骨折患者血浆中CGRP浓度增加,骨折局部含CGRP的神经元数目明显增多[3]。本课题组前期研究已经证实,CGRP可促进成骨细胞增殖、分化,抑制破骨细胞生成,促进骨折修复,许多信号途径如c AMP/PKA、RANKL、BMP、NO/NOS等都参与了CGRP对骨折愈合过程的调控[4,5]。但CGRP对成骨细胞、破骨细胞的前体细胞——骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)的成骨功能调控如何以及相关信号转导通路的研究还鲜有报道。BMSCs来源于中胚层,具有容易分离培养、可塑性强、可多向分化、能够在体外快速扩增等优点,在骨组织工程中受到高度关注[6]。有学者通过激光共聚焦发现小鼠BMSCs表面存在着CRLR和RAMP。同时,m RNA及蛋白水平检测也证实了人BMSCs表面存在CGRP受体[7,8]。Hippo信号通路具有高度保守性,对细胞调控的生物学功能表现为抑制细胞增殖、促进细胞凋亡。Hippo通路的三大组成部分包括:上游信号分子(Ex,Mer等)、核心激酶级联反应链(Mst1/2、Lats1/2、Sav等)、下游效应分子(Yap/Taz)。上游分子接收并传递外界信号,激活核心激酶链的磷酸化级联反应,引起Yap/Taz的活性改变和核/质转位,最终激活或抑制下游靶基因的转录及相关蛋白表达[9]。Hippo通路在哺乳动物中的验证开始于小鼠肝脏。研究人员过表达小鼠肝脏细胞内的Yap基因后发现细胞增殖加快,肝脏体积达到正常肝脏的3-4倍。抑制Yap的表达后,肝细胞凋亡水平升高,肝脏最终恢复至正常大小[10]。有报道指出,Mstl/2和Savl在维持肝细胞静态和小鼠出生后限制肝脏生长具有重要作用[11]。另外,值得注意的是,该通路在胚胎发育过程及成体干细胞分化命运决定中也发挥了一定的调控作用[12]。综上所述,本文旨在进一步揭示CGRP在骨折愈合中的作用,研究CGRP对小鼠BMSCs增殖及成骨分化的影响,并对Hippo通路在这个过程中发挥的作用进行初步探讨。研究方法:1、体外分离、培养、鉴定原代Balb/c小鼠BMSCs。2、在体外成骨诱导培养的BMSCs中加入不同浓度的CGRP(10-10、10-9、10-8、10-7mol/L),处理48 h后测试碱性磷酸酶(ALP)活性,筛选的优势浓度。3、CGRP处理BMSCs7d后进行茜素红染色,检测细胞的成骨分化情况。4、应用Western blot检测CGRP作用于BMSCs后,Hippo通路核心分子Mst1/2蛋白磷酸化的表达水平。5、利用Hippo通路抑制剂维替泊芬(Verteporfin)阻断下游Yap信号,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测其对成骨相关因子Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ)、Runt相关转录因子2(Runx2)m RNA的表达影响。结果:1、成功分离并扩增纯化Balb/c小鼠BMSCs。2、ALP活性检测结果显示,与空白对照组相比,10-9、10-8、10-7 mol·L-1浓度范围的CGRP都能显著促进小鼠ALP活性的增加(P<0.05),且以10-8 mol·L-1浓度的CGRP为最佳刺激浓度。3、用10-8 mol·L-1浓度的CGRP处理后,茜素红染色显示钙化结节明显增多。CGRP能够显著上调p-Mst1/2蛋白的表达(P<0.05)。4、当运用了抑制剂Verteporfin时,显著降低了CGRP诱导的Runx2、collagenⅠm RNA的表达(P<0.05)。结论:1、通过贴壁筛选的手段可成功从Balb/c小鼠下肢骨骨髓中获得所需的BMSCs。2、神经肽CGRP能显著地促进小鼠BMSCs增殖和成骨分化,优势刺激浓度为10-8mol/L。3、Hippo信号通路在CGRP促进小鼠BMSCs成骨分化过程中起正向调控作用。