论文部分内容阅读
成纤维细胞生长因子受体（Fibroblast growth factor receptor,FGFR）现已成为肿瘤精准诊疗领域的重要靶点,在多种肿瘤中呈现较高水平的表达。FGFR主要分为FGFR1-4四种亚型,成纤维细胞生长因子（Fibroblast growth factor,FGF）与之结合后,形成FGF/FGFR信号通路,在肿瘤发生、生存、侵袭、血管生成、转移、复发、上皮间质转化（Epithelial–mesenchymal transition,EMT）中比经典的肉瘤致癌因子-受体酪氨酸激酶（C-ros oncogene 1,receptor tyrosine kinase,ROS1）、鼠类肉瘤癌基因病毒同源物B1（Mouse sarcoma virus oncogene homolog B1,BRAF）、间变性淋巴瘤激酶（Anaplastic lymphoma kinase,ALK）或表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor,EGFR）信号通路具有更高的异质性。FGF/FGFR信号通路的激活也被认为是多种肿瘤放化疗及靶向治疗获得性耐药的因素之一,此外,FGF/FGFR信号通路可以抑制IFNγ刺激的JAK/STAT信号通路,降低B2M、CXCL10和PD-L1的表达,可能是免疫检查点抑制剂治疗的另一种耐药机制。由于FGF/FGFR信号通路在肿瘤发生发展中的重要作用,抑制FGFR的靶向肽和新型药物的研发如雨后春笋,相继进入临床试验阶段。厄达替尼（JNJ42756493）、英菲格拉替尼（BGJ398）、罗格拉替尼（BAY1163877）、培米替尼（INCB54828）目前正在进行Ⅲ期临床试验,除厄达替尼靶向FGFR1-4之外,其余三种药物均靶向FGFR1-3,为FGFR高表达的患者带来了新的希望。作为FGFR的亚型,关于FGFR1在肿瘤发生发展中的作用的研究最为深入,对FGFR1表达情况的动态监测有助筛选出可从FGFR抑制剂治疗中获益的患者。FGFR1在非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）患者肿瘤组织中的表达如何?可否开发以FGFR1为靶点的分子影像探针以协助NSCLC的诊断?FGFR1作为分子影像探针对NSLCL的诊断效果如何?本研究针对上述问题进行了系列研究。即通过免疫组化染色方法研究了NSCLC患者肿瘤组织的FGFR1的表达水平,并对上述患者的18F-FDG PET/CT显像进行了回顾性分析,评估18F-FDG PET/CT常规代谢参数SUVmax对FGFR1表达水平的预测价值。构建了FGFR1靶向的分子影像探针,评价了核素18F标记的靶向FGFR1的分子影像探针体内外特性及动物显像效果。旨在实现全身、无创、动态、实时监测患者FGFR1表达水平,实现肿瘤FGFR1表达水平的可视化诊断,协助筛选出可从FGFR1抑制剂治疗中获益的患者。同时,为探索18F-FGFR1-HER2双靶点分子探针在肿瘤诊断方面的可行性,本研究合成HER2亲合体,并完成正电子核素18F的标记,评估分子影像探针[18F]Al F-NOTA-HER2亲合体的体外特性,并与[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide对比,为后续18F-FGFR1-HER2双靶点分子探针的研发奠定基础。第一部分FGFR1在非小细胞肺癌中表达及其与18F-FDG PET/CT显像代谢参数SUVmax的相关性目的:研究非小细胞肺癌患者FGFR1的表达状况,及非小细胞肺癌患者FGFR1表达水平与18F-脱氧葡萄糖(18F-Fluorodeoxyglucose,18F-FDG)正电子发射型计算机断层显像/X线计算机体层成像（Positron emission tomography/Computed tomography,PET/CT）检查中的常规代谢参数,即原发病灶的最大标准摄取值（Maximum standard uptake value,SUVmax）的相关性。评价FGFR1表达水平与SUVmax的相关性。方法:回顾性分析了2017年1月至2021年11月于河北医科大学第四医院术前行PET/CT检查,术后病理检查确诊为NSCLC的患者共86例,其中肺鳞癌40例,肺腺癌46例。应用免疫组化方法,对术后病理蜡块标本进行免疫组化染色,以判断FGFR1表达情况。同时通过PET/CT图像处理工作站系统勾画18F-FDG PET/CT显像病灶感兴趣区（Region of interests,ROIs）,自动计算SUVmax,分析病灶FGFR1表达水平及临床病理特征与SUVmax之间的相关性。结果:86例入组患者中,FGFR1阳性表达患者55例,阴性表达患者31例,肺腺癌FGFR1阳性率为93.48%（43/46）,肺鳞癌FGFR1阳性率为30%（12/40）（P=0.000）。性别、年龄、SUVmax与FGFR1的表达水平无相关性。小结:1.FGFR1在肺腺癌患者中的阳性率显著高于肺鳞癌患者。2.18F-FDG PET/CT代谢参数SUVmax与非小细胞肺癌患者FGFR1的表达水平无相关性。第二部分18F-FGFR1分子影像探针构建及体外靶向性的研究目的:在非小细胞肺癌中,有93.48%的肺腺癌患者存在FGFR1阳性表达,故FGFR1可作为分子影像的潜在靶点,针对该靶点研制分子影像探针,可实现PET分子影像诊疗。合成FGFR1靶向肽,并完成正电子核素18F的标记,评估分子影像探针[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide的体外稳定性及靶向性。方法:1.应用多肽固相合成法合成靶向FGFR1的分子影像探针NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide,应用[18F]Al F法对新型分子影像探针进行正电子核素18F的标记。为验证分子影像探针的体外稳定性,将[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide分别与等体积生理盐水或新鲜血清于37℃条件下共同孵育,分别于混合即刻、60min、120min和4h取样,通过反相高效液相色谱法（Reverse phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC）分析探针的体外稳定性。2.研究18F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide的体外靶向性,通过蛋白质免疫印迹（Western blot,WB）法筛选出5种细胞株,分别为人膀胱癌细胞株RT-112、人肺鳞癌细胞株NCI-H520、人肺腺癌细胞株A549和Calu-3以及人胃癌细胞株SNU-16,并检测各细胞株FGFR四种亚型表达水平。3.在细胞培养标准条件下,向各细胞株中加入等体积等放射性活度的分子影像探针[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide,研究各细胞株对标记后的分子影像探针摄取率的差异,并配置p H值约为2.5的醋酸缓冲液,用以洗脱细胞膜表面的分子影像探针,研究研究各细胞株对标记后的分子影像探针内化率的差异。另选择摄取率最高的细胞进行阻断实验,以验证分子影像探针[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide对FGFR1的靶向特异性。通过饱和结合实验进一步评价分子影像探针[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide对FGFR1的亲和力。结果:1.[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide制备过程较为简单,未经衰减校正的标记率约为16.67%,放射化学纯度＞98%。与等体积生理盐水或新鲜血清混合孵育4h内放射化学纯度均在90%以上。2.蛋白质免疫印迹与免疫荧光结果表明,FGFR1在RT-112细胞株中表达水平最高,FGFR2在SNU-16细胞株中表达水平最高,FGFR3在Calu-3和RT-112细胞株中均呈现高水平表达,FGFR4在Calu-3和A549细胞株中均呈现高水平表达。3.FGFR1高表达的RT-112细胞在加入分子影像探针[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide后15min、30min、60min和120min的摄取率高于其余4种细胞,差异有统计学意义（P=0.000）。各细胞在各时间节点内化率的差异不完全具有统计学意义。RT-112细胞对分子影像探针[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide的摄取可被过量未标记肽阻断。且分子影像探针[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide对FGFR1具有较强的亲和力。小结:1.分子影像探针[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide制备过程较为简单,标记率及放射化学纯度高,体外稳定性好。2.筛选出的5种细胞系FGFR亚型表达各异,其中FGFR1在RT-112细胞中表达水平最高。3.细胞摄取实验表明,分子影像探针[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide可被FGFR1高表达的细胞选择性摄取。内化实验表明,细胞对分子影像探针[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide的内化率与FGFR1的表达无明显相关性。阻断实验表明,分子影像探针[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide与FGFR1的结合具有靶向特异性。饱和结合实验表明,分子影像探针[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide对FGFR1具有较强的亲和力。第三部分18F-FGFR1分子影像探针荷瘤裸鼠显像及体内分布的研究目的:构建人膀胱癌细胞RT-112、人肺鳞癌细胞NCI-H520、人肺腺癌细胞A549、人胃癌细胞SNU-16和人肺腺癌细胞Calu-3荷瘤裸鼠模型,观察分子影像探针[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide在荷瘤裸鼠模型中的显像效果、体内稳定性、体内分布等特性。方法:1.于BALB/c裸鼠右前肢外侧皮下分别注射RT-112、NCI-H520、A549、SNU-16和Calu-3细胞,待肿瘤体积生长至适宜大小时,每组随机选取荷瘤裸鼠5只,经尾静脉注射分子影像探针[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide,于注射后30min、60min和120min行Micro-PET/CT显像,观察显像剂在肿瘤中的聚集和体内主要脏器的分布情况。2.根据荷瘤裸鼠Micro-PET/CT显像结果,在肿瘤部分显像剂浓聚程度最高的荷瘤裸鼠模型组中随机选取5只,经尾静脉注射过量未标记肽,以阻断细胞膜表面的受体,同时注射分子影像探针[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide,分别于注射后30min、60min和120min行Micro-PET/CT显像,比较阻断组与未阻断组肿瘤部位显像剂浓聚程度的差异。3.在各组荷瘤裸鼠Micro-PET/CT显像的图像上,通过勾画ROIs分析分子影像探针[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide在荷瘤裸鼠主要组织器官中的分布情况,计算肿瘤与肌肉（Tumor to muscle ratio,T/M）、肿瘤与肝脏（Tumor to liver ratio,T/L）、肿瘤与肾脏（Tumor to kidney ratio,T/K）%ID/g的比值。4.于注射分子影像探针[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide 60min后收集尿液样本,通过RP-HPLC分析分子影像探针[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide的体内稳定性。结果:1.经尾静脉注射[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide分子影像探针后,RT-112细胞荷瘤裸鼠肿瘤部位可见显像剂浓聚,NCI-H520细胞荷瘤裸鼠次之,A549、SNU-16和Calu-3细胞荷瘤裸鼠肿瘤部位未见明显显像剂浓聚。2.随机选取5只RT-112细胞荷瘤裸鼠模型进行阻断实验,注射过量未标记肽后,分子影像探针[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide在肿瘤部位的浓聚程度明显减低。3.体内分布实验表明,分子影像探针[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide主要经泌尿系统代谢,可特异性浓聚于FGFR1高表达的RT-112细胞荷瘤裸鼠的肿瘤部位,具有较高的T/M、T/L、T/K值,且其在FGFR1高表达的肿瘤组织中的浓聚程度随注射时间延长逐渐降低。4.体内稳定性实验表明,分子影像探针[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide在尿液中未见明显脱标现象。小结:1.分子影像探针[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide主要浓聚于FGFR1高表达的RT-112细胞荷瘤裸鼠的肿瘤部位,且分子影像探针[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide在荷瘤裸鼠肿瘤部位的摄取可被过量未标记肽阻断,证明了该分子探针可特异性靶向FGFR1。2分子影像探针[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide有较好体内稳定性与代谢特征。3.[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide可用于FGFR1高表达肿瘤显像,是一种有潜在应用价值分子影像探针。第四部分18F-FGFR1-HER2双靶点分子影像探针构建的前期研究目的:合成HER2亲合体,并完成正电子核素18F的标记,评估分子影像探针[18F]Al F-NOTA-HER2亲合体的体外特性,并与[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide对比,为后续18F-FGFR1-HER2双靶点分子探针的研发奠定基础。方法:1.应用多肽固相合成法合成靶向HER2的分子影像探针NOTA-HER2亲合体,应用[18F]Al F法对新型分子影像探针进行正电子核素18F的标记。2.在细胞培养标准条件下,以同样的方法进行细胞摄取、内化、阻断和饱和结合实验,并将结果与[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide相应细胞实验的结果进行比较。3.于BALB/c裸鼠右前肢外侧皮下分别注射胃癌NCI-N87和MKN74细胞,待肿瘤体积生长至适宜大小时,每组随机选取荷瘤裸鼠5只,经尾静脉注射分子影像探针[18F]Al F-NOTA-HER2亲合体,于注射后30min、60min和120min行PET/CT显像,观察显像剂在肿瘤中的聚集和体内主要脏器的分布情况,计算各时间节点的T/M值。将上述结果与[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide相应实验的结果进行比较。结果:1.[18F]Al F-NOTA-HER2亲合体制备过程较为简单,未经衰减校正的标记率约为32.69%,放射化学纯度＞98%。2.[18F]Al F-NOTA-HER2亲合体可与HER2特异性结合,且其亲和力高于[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide对FGFR1的亲和力。3.PET/CT显像结果显示,分子影像探针[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide和[18F]Al F-NOTA-HER2亲合体均可与目标受体特异结合,获得良好的显像效果,同时两者的最佳显像时间窗存在差异。小结:1.分子影像探针[18F]Al F-NOTA-NOTA-HER2制备过程较为简单,标记率及放射化学纯度高,具有良好的体内外靶向特异性。2.分子影像探针[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide和[18F]Al F-NOTA-HER2亲合体均可与目标受体特异结合,为FGFR1-HER2双靶点分子影像探针的研发奠定基础。结论:1.FGFR1阳性表达常见于肺腺癌患者,而PET/CT检查中常规代谢参数SUVmax与肺癌患者FGFR1的表达水平无相关性。2.分子影像探针[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide制备过程较为简单,标记率高,体外稳定性好,在体外可特异性靶向FGFR1。3.分子影像探针[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide体内稳定性好,在Micro-PET/CT显像中可特异性浓聚于FGFR1高表达的荷瘤裸鼠的肿瘤部位,肿瘤/肌肉比值高。探针经泌尿系统排泄,非靶组织摄取低,具有良好的药代动力学特征,且分子影像探针[18F]Al F-NOTA-（PEG2）-FGFR1-peptide在荷瘤裸鼠肿瘤部位的摄取可被过量未标记肽阻断,证明了该分子影像探针可特异性靶向FGFR1。表明该探针是一种有潜在应用价值分子影像探针。4.FGFR1-HER2双靶点分子影像探针的研发在肿瘤显像诊断方面具有一定的可行性。