背景精索静脉曲张(varicocele,VC)已被世界卫生组织(World Health Orgnization,WHO)列为导致男性不育的主要致病原因,全球范围内发病率约为15%。精索静脉曲张的发病机制主要是:精索静脉血液回流受阻、静脉瓣膜失效,血液反流导致精索蔓状静脉丛的伸长、扩张和迂曲。但目前对其发病的病理机制尚无全面明确的认识。精索静脉曲张导致的附睾和睾丸组织的低氧和氧化应激反应可能是引起附睾、睾丸功能减退,最终导致弱精子症发生的一个重要因素。既往研究发现低氧诱导因子1 α亚基(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1 α)能稳定存在于低氧环境组织中,组织低氧程度越高,HIF-1 α的蛋白表达越显著,所以可将HIF-1 α作为一种组织缺氧的内部标志物。活性氧(reactive oxygen species,ROS)是分子氧经氧化还原反应产生的一系列代谢产物,对于精子来说,ROS的过度产生或保护精子免受氧化损伤的抗氧化系统的缺陷,都会导致精子功能障碍。肿瘤抑制因子p53于肿瘤组织中最早发现,其可调控细胞周期,某些病理情况可使其表达过量,从而诱导细胞凋亡过度。目的本研究中,我们观察精索静脉曲张大鼠精索静脉扩张情况;通过准确称重观察精索静脉曲张大鼠附睾及睾丸体重指数;通过计算机辅助精子分析系统(computer assisted sperm analysis,CASA)检测精子浓度及精子活动率;苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE staining)观察附睾管上皮组织和睾丸曲细精管组织的变化情况;附睾组织唾液酸(sialic acid,SA)、肉毒碱和ROS含量,以及睾丸组织ROS含量通过酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA)的方法检测;附睾及睾丸组织HIF-1 α、p53的表达则通过免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)及免疫印迹试验(WesternBlot)的方法来进行检测。研究以HIF-1 α表达增加为标志的组织低氧与附睾管上皮组织及睾丸曲细精管组织变化,乃至与弱精子症发生之间的关系;分析附睾与睾丸组织中p53的表达量与ROS增加之间的关系;探讨精索静脉曲张导致的附睾及睾丸功能的损害与精子活动率之间的关系,从而寻找弱精子症可能的发病机制。方法初始体重250-280克(gram,g)的健康雄性斯泼累格·多雷(Sprague Dawley,SD)大鼠90只,由北京大学医学部实验动物科学部提供。按随机分组的方法分为手术组(30只)、假手术组(30只)和正常对照组(30只)。按照Turner的方法构建手术组实验性大鼠精索静脉曲张模型:水合氯醛腹腔麻醉成功后的大鼠以大鼠板固定,取剑突下腹部正中切口,逐层切开入腹后推开腹内容物,于左侧腹膜后显露左肾静脉,游离部分左肾静脉后,在左肾上腺静脉与下腔静脉之间的左肾静脉段放置一直径0.8毫米(millimeter,mm)的金属杆,以4-0的丝线将金属杆与左肾静脉一并结扎,结扎完成后小心抽出金属杆,此时可见左肾静脉扩张。观察左肾无明显缺血后,逐层缝合切口。假手术组模型的建立:于左侧腹膜后显露左肾静脉后,只是于左肾静脉穿线打空结,而不缩窄左肾静脉。正常对照组不作任何处理。各组大鼠均于手术组术后49天(day,d)腹腔麻醉后取材。取材前大鼠称重,显露左侧精索静脉后以游标卡尺精确测量左精索静脉直径,左侧附睾及睾丸分别称重。应用扩散法收集左侧附睾尾部精子:切取左附睾后快速剪取左附睾尾部组织,置于37摄氏度(centigrade,℃)预热好的2毫升(milliliter,ml)生理盐水中,组织间快速剪碎,37 ℃恒温2分钟(minute,min),取摇匀后的悬浊液10微升(microliter,μl)加到37 ℃预热好的血细胞计数板上。应用CASA按《WHO精液检查与处理实验室手册》(第五版)行精子浓度及精子活动率(前向运动+非前向运动,progressive + non-progressive,PR+NP)的检测。大鼠左附睾组织匀浆中的唾液酸、肉毒碱及ROS含量用ELISA试剂盒检测。左侧睾丸组织匀浆中ROS含量用DCFDA法的ELISA试剂盒检测。唾液酸和肉毒碱吸光度值用570纳米(nanometer,nm)波长进行测定;ROS吸光度值用510nm波长进行测定。附睾和睾丸组织HE染色:将附睾或睾丸组织与4%多聚甲醛混合,乙醇脱水、石蜡包埋,切片,厚度为5微米(micronmeter,μμm),固定,附睾及睾丸组织切片,切片进行HE染色,然后利用乙醇脱水,二甲苯透明,放在中性树脂板材上,显微镜下观察。采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(streptavidin-perosidase,SP法)检测左侧附睾和睾丸组织HIF-1 α和p53表达。石蜡切片烤片、常规二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水。3%过氧化氢(hydrogen peroxide,H202)阻断灭活内源性过氧化物酶。抗原修复后以正常羊血清工作液封闭,37℃ 10min,HIF-1α滴加Anti-HIF-1 α(Mouse monoclonal to HIF-1-alpha,Abcam,abl):1:400 稀释,p53 滴加 Anti-p53(Mouse monoclonal to p53,Abcam,ab26):1:1000 稀释,4℃ 冰箱孵育过夜;滴加生物素标记Anti-mouse IgG,用封闭液按1:1000稀释,37℃孵育30min,滴加辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的链霉素卵白素工作液,37℃孵育 30min,二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)/H2O2反应染色,常规脱水、透明、干燥、封片。使用高倍显微镜观察免疫组化切片,至少观察5个视野。根据阳性细胞的百分比、染色强度和免疫组化半定量评分的标准评估HIF-1α和p53的表达:0分,<1%;1分,介于1%-10%之间;2分,11%-50%之间;3分,51%-80%之间;4分,>80%。染色强度评分:1分,弱;2分,中等;3分,强。前面这两个分值相加,得出最后的分值。附睾或睾丸组织以二喹啉甲酸(bicinchoninic,BCA)法测定蛋白浓度后,进行蛋白质SDS-PAGE电泳(100微克(microgram,μg),10%)和蛋白转移。转膜后用封闭液按以下比例对一抗进行稀释及抗体孵育:Anti-HIF-1 α(Mouse monoclonal to HIF-1-alpha,Abcam,abl):1:400,4℃过夜;Anti-p53(Mouse monoclonal to p53,Abcam,ab26):1:1000,4℃过夜;Anti-β-actin:1:3000,4℃过夜。取出一抗反应结束的聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,TBST摇洗,10min×3次。用封闭液按照不同比例稀释二抗及孵育:Anti-mouse IgG,用封闭液按1:1000稀释,室温孵育90min。二抗浸泡孵育结束后,置于摇床上以TBST液洗膜,10min×3次。将PVDF膜在暗室中与胶片压片,显影定影。采用Quantity one进行蛋白条带灰度分析。采用 SPSS 17.0 统计软件(Statistical Package for Social Sciences version 17.0,SPSS 17.0)进行数据分析,计量资料采用均数±标准误(Mean ±SE)表示,两组比较采用t检验,多组比较采用单因素的方差分析(One-wayANOVA),ROS与p53表达的相关性分析采用直线回归分析。P<0.05认为有统计学意义。结果实验性大鼠精索静脉曲张模型建立成功的标志:左精索静脉直径>lmm,双肾重量无明显差别。最终成功建模:手术组27只(剔除左睾丸+左附睾萎缩1只、左睾丸+左附睾+左肾萎缩1只、左肾萎缩1只),假手术组30只,正常对照组30只。精索静脉曲张手术组左侧精索静脉直径相较其他两组明显增粗(P=0.000<0.001),假手术组和对照组左侧精索静脉直径差异无显著性差异。三组大鼠体重之间无明显差异,三组大鼠左侧附睾重量之间无明显差异。精索静脉曲张手术组左侧睾丸重量相较另外两组明显减小(P=0.0012<0.01)。精索静脉曲张手术组左侧睾丸体重指数较其他两组也是明显降低(睾丸体重指数=左侧睾丸重量/大鼠体重×100%)(P=0.001<0.01)。三组大鼠精子浓度经One-way ANOVA检验,无统计学意义。三组大鼠前向运动精子(PR)百分比和精子活动率(PR+NP)经One-way ANOVA检验,精索静脉曲张手术组以上两项精子活动力指标较其它两组均显著降低,差异有统计学意义(PR:P=0.000<0.001;PR+NP:P=0.046<0.05)。假手术组与正常对照组间两项指标无统计学意义。经One-way ANOVA检验,手术组左侧附睾组织唾液酸和肉毒碱含量低于假手术组和正常对照组,差异有统计学意义(唾液酸:P=0.007<0.01;肉毒碱:P=0.008<0.01);手术组左侧附睾组织ROS含量高于假手术组和正常对照组,差异有统计学意义(P=0.000<0.001)。精索静脉曲张手术组大鼠左侧睾丸组织ROS含量较另外两组明显增高(P=0.000<0.001)。假手术组与正常对照组间两项指标无统计学意义。HE染色观察发现:精索静脉曲张手术组曲张侧附睾管上皮细胞及睾丸曲细精管上皮细胞数量明显少于正常对照组和假手术组,精索静脉曲张手术组曲张侧附睾管上皮细胞及睾丸曲细精管上皮细胞排列相对于对照组与假手术组明显疏松无序,并伴有空泡样变性。免疫组织化学:根据HIF-1 α表达量的评分标准,手术组大鼠附睾和睾丸组织HIF-1 α表达阳性率明显高于正常对照组和假手术组(P=0.000<0.0001),而正常对照组和假手术组之间比较没有统计学差异。手术组大鼠附睾和睾丸组织p53表达阳性率明显高于另外两组(P= 0.000<0.0001),而对照组和假手术组之间比较没有统计学差异。免疫印迹试验:以HIF-1α的灰度值与相应内参灰度值的比值作为HIF-1α的相对表达量。免疫印迹试验结果表明精索静脉曲张手术组左侧附睾和睾丸HIF-1α蛋白相较假手术组和正常对照组明显增高(P=0.000<0.001)。假手术组与正常对照组中的表达差异无统计学意义。以p53的灰度值与相应内参灰度值的比值作为p53的相对表达量。免疫印迹结果表明手术组左侧附睾和睾丸组织p53蛋白和假手术组及正常对照组表达显著增高(P=0.000<0.001)。假手术组与正常对照组中的表达差异无统计学意义。直线回归分析发现:精索静脉曲张手术组左侧睾丸组织ROS含量与相应的p53条带的相对表达量呈显著正相关(P=0.041<0.05;r=0.387)。三组大鼠左侧睾丸组织ROS含量与相应的p53条带的相对表达量也呈显著正相关(P=0.000<0.001;r=0.618)。结论1.精索静脉曲张导致以HIF-1 α表达明显增加为标志的附睾及睾丸组织低氧。2.精索静脉曲张会导致以附睾组织唾液酸及肉毒碱含量降低为标志的附睾功能的损害。3.低氧环境导致附睾及睾丸组织ROS的堆积增加,促使附睾和睾丸组织内p53表达异常增加。4.附睾和睾丸组织内p53表达异常增加,诱导附睾管上皮和睾丸曲细精管上皮细胞大量凋亡,从而导致附睾和睾丸功能的损害,进而影响精子的成熟和获得前向运动的能力,导致精子活动力的降低。背景弱精子症是引起男性不育的常见病因。弱精子症主要表现为精子活力低下,运动能力降低,其病因及发病机制尚不十分明确。既往研究将弱精子症的病因归纳为以下几个方面:①生殖泌尿系统感染;②精索静脉曲张;③生殖-性腺轴分泌功能异常;④附属性腺的非炎症性功能改变;⑤免疫因素;⑥精子颈、尾部结构缺陷;⑦年龄;⑧环境污染等。但上述这些现阶段已知病因仅仅是从精子生存的外环境因素等来进行的分析的,尚缺乏对精子本身结构异常及生理因素引起弱精子症发生的研究。近年来,众多研究表明离子跨膜转运对精子的生理活动有着非常重要的影响。目前研究表明,精子在附睾中获得前向运动能力、鞭毛运动、女性生殖道中的超活化以及精卵结合过程中发生顶体反应等过程与Ca2+的跨膜转运有着极其重要的关系。研究发现,一种特异性存在于精子顶体及鞭毛主段的阳离子通道(cation channel of sperm,CatSper)蛋白家族能够介导Ca2+流动,进而对精子的运动能力和超活化过程进行调控,并在精子在附睾中获得前向运动能力过程及精卵结合过程中的顶体反应阶段发挥重要的诱导和调控作用。进而我们猜测:若CatSper通道蛋白的功能出现问题,精子的活动力将会大幅下降,导致弱精子症的发生。肉毒碱类药物在男性不育治疗中的作用已为多个临床研究所证实。肉毒碱存在左旋、右旋两种异构体,右旋肉毒碱具有毒性,并没有任何有益的作用。哺乳动物体内仅存在左旋肉毒碱(L-carnitine,左卡尼汀),其在哺乳动物正常生理活动中发挥着不可或缺的作用。大量的动物模型与临床研究证实,精索静脉曲张患者、隐睾患者和长期接触电磁辐射患者等的睾丸生精功能都存在不同程度的损伤,左旋肉毒碱能够对这些受损的生精功能起到一定的保护作用,并能减轻这些不良因素对精子活力的影响。目的本研究中我们采用随机、双盲、对照等循证医学方法,应用计算机辅助精子分析系统(computer assisted sperm analysis,CASA)观察成品化的左旋肉毒碱(左卡尼汀口服液)对弱精子症患者精子浓度及精子活动率的影响;免疫印迹试验(Western Blot)的方法观察弱精子症患者精子CatSper通道蛋白较正常人群是否下降;如有下调,通过应用左旋肉毒碱类药物治疗是否可以增强CatSper通道蛋白的表达,从而增强精子活力及超活化能力,最终起到治疗弱精子症的作用。方法2011年6月至2012年4月,山东中医药大学第二附属医院生殖医学科和北京大学第三医院生殖医学中心门诊采集就诊者的精液标本。根据标准,选择初诊精液分析正常的精液标本40份;严格按照纳入及排除标准,共120例弱精子症患者被纳入。按照双盲、对照的原则将入组患者随机分为3组,40位左卡尼汀治疗组患者给予左卡尼汀口服液,1.0g,bid,po+生活干预。40位安慰剂治疗组患者给予安慰剂口服,1.0g,bid,po+生活干预。40位空白对照组患者仅给予生活干预1个月,不做药物治疗。三组均以一个月为治疗疗程。收集治疗前后各组的精液标本。患者手淫法采集精液于带盖的无菌取精杯后置于37摄氏度(centigrade,℃)恒温箱,每15分钟(minute,min)观察精液液化情况,精液液化后,去皮称重。取10微升(microliter,μl)液化完全的精液加到提前预热20min以上的血细胞计数板的标本槽里,加专用盖玻片,采用计算机辅助精子分析系统按《WHO人类精液检查与处理实验室手册》(第五版)行精子浓度及精子活动率(前向运动+非前向运动,progressive+non-progressive,PR+NP)的检测。留取行精液分析完毕后的精液标本1.5毫升(milliliter,ml),提取并用二喹啉甲酸(bicinchoninic,BCA)法测定蛋白浓度后,进行蛋白质十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)电泳(100μg上样,10%)和蛋白转移。转膜后用封闭液按以下比例稀释一抗:①Anti-GAPDH:1/1000,4℃过夜;②Anti-CatSper(H-300):1/100,4℃过夜;③Anti-CatSper2(H-60):1/100,4℃过夜;④Anti-CatSper3(M-201):1/100,4℃过夜。取出一抗反应结束的聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,TBST摇洗,10min××3次。用封闭液按照不同比例稀释二抗:①Anti-mouse IgG:1/1000,室温孵育1h;②Anti-rabbit IgG:1/1000稀释,室温孵育1h。取出二抗反应结束的PVDF膜,TBST液摇床洗膜,10min×3次。在暗室中将PVDF膜压片,显影定影后用Quantity one进行蛋白条带灰度分析。试验所得数据采用 SPSS 17.0 统计软件(Statistical Package for Social Sciences version 17.0)进行分析,计量资料采用均数±标准误(Mean±SE)表示,两组比较采用t检验,多组比较采用单因素方差分析(One-wayANOVA),P<0.05认为有统计学意义。结果经One-wayANOVA检验,三组弱精子症入组患者的年龄、平均不育时间、禁欲天数、治疗前精子浓度、前向运动精子百分率(PR)、精子活动率(PR+NP)各项指标差异均无统计学意义(P>0.05)。三组患者治疗后收集空白对照组37例(剔除失随访2例、资料不全1例),安慰剂组35例(剔除失随访3例、资料不全1例、未遵医嘱用药1例),左卡尼汀组34例(剔除失随访3例、资料不全1例、未遵医嘱用药2例)。①经t检验,三组患者组内比较,每组患者治疗前后行精液分析时禁欲天数无统计学差异(P>0.05);每组患者治疗前后精子浓度无统计学差异(P>0.05)。②经One-way ANOVA检验,三组患者组间比较,治疗后行精液分析时禁欲天数无统计学差异(P>0.05);治疗后精子浓度无统计学差异(P>0.05)。③经t检验,左卡尼汀治疗组经治疗后,精子前向运动百分率明显高于治疗前,有统计学差异(PR:P<0.0001);左卡尼汀治疗组经治疗后,精子活动率明显高于治疗前,有统计学差异(PR+NP:P<0.0001);④经One-way ANOVA检验,1个治疗疗程后,左卡尼汀治疗组患者精子前向运动百分率明显高于安慰剂治疗组及空白对照组,有统计学差异(PR:P=0.0008<0.001)。左卡尼汀治疗组患者精子活动率明显高于安慰剂治疗组及空白对照组,有统计学差异(PR+NP:P<0.0001)。CatSperl蛋白表达指标用CatSperl相对表达量(CatSperl相对表达量=CatSperl的灰度值/相应内参灰度值)来表示。免疫印迹结果经One-way ANOVA检验,表明弱精子症组精子CatSperl蛋白相较正常人群组明显减少(P<0.0001)。经t检验,左卡尼汀组患者治疗后精子CatSperl蛋白相对表达量较治疗前有显著增加,差异有统计学意义(P<0.0001)。CatSper2蛋白表达指标用CatSper2相对表达量(CatSper2相对表达量=CatSper2的灰度值/相应内参灰度值)来表示。免疫印迹结果经One-way ANOVA检验,表明弱精子症组精子CatSper2蛋白相较正常人群组明显减少(P<0.0001)。经t检验,左卡尼汀组患者治疗后精子CatSper2蛋白相对表达量较治疗前有显著增加,差异有统计学意义(P<0.0001)。CatSper3蛋白表达指标用CatSper3相对表达量(CatSper3相对表达量=CatSper3的灰度值/相应内参灰度值)来表示。免疫印迹结果经One-way ANOVA检验,表明弱精子症组精子CatSper3蛋白相较正常人群组明显减少(P<0.0001)。经t检验,左卡尼汀组患者治疗后精子CatSper3蛋白相对表达量较治疗前有显著增加,差异有统计学意义(P<0.0001)。结论1、CatSper通道蛋白的表达量减少或通道功能障碍是弱精子症发生的原因之。2、肉毒碱类药物对弱精子症患者有较好的临床疗效。其机制可能是:通过调控精子CatSper通道蛋白的表达来调控精子运动力、超激活后的运动、精子穿透透明带发生顶体反应及精卵结合的能力。