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背景:
抗菌药物的大量及不合理使用,使得细菌在抗生素选择压力下耐药菌株不断产生,其中细菌通过基因的水平转移,获得外源性耐药基因是加快临床耐药菌株产生的重要原因。与细菌耐药基因水平转移密切相关的遗传结构有质粒、转座子、整合型噬菌体以及近年来在细菌中发现的一种天然克隆表达系统--整合子(integron)。整合子通过位点特异性重组捕获外源性基因盒(gene cassttes)并使之表达,同时整合子可位于质粒上,或自身作为转座子的一个组成部分而参与转移,使耐药基因发生菌属内和菌属间的播散。整合子因其在细菌耐药基因水平转移中的重要作用而受到国内外研究者的关注。
目的:
本研究旨在调查大肠埃希菌临床耐药株中整合子种类及分布,分析整合子与这些细菌耐药和多重耐药的关系,分析本地区耐药菌株中整合子的演变,并进一步探讨整合子参与这些菌株耐药和多重耐药的分子机制。
材料与方法:
1.收集本地区临床分离的大肠埃希菌,采用纸片扩散法及二倍平板稀释法测定其药物敏感性和测定MIC值,细菌总DNA抽提试剂盒提取细菌总DNA,改良碱裂解法提取细菌质粒DNA;
2.采用整合酶基因PCR法检测整合子阳性率;
3.按ESBLs检测结果,将大肠埃希菌分为整合子阳性组和整合子阴性组,分析整合子与这些细菌耐药和多重耐药的关联;
4.采用整合子PCR法扩增整合子可变区,联合DNA测序技术进行可变区耐药基因盒分析。
结果:
1.本地区大肠埃希菌中整合子的检出率为59.0%(309/524),其中,Ⅰ类整合子的检出率为58.4%(306/524),Ⅱ类整合子的检出率为0.57%(3/524),未检出Ⅲ类整合子;
2.将大肠埃希菌分为ESBLs阴性组和阳性组,分析两组菌对氨基糖苷类、β-内酰胺类和喹诺酮类等临床常用抗生素药物敏感性,阳性组显著高于阴性组;
3.在Ⅰ类整合酶基因扩增阳性的菌株中,大肠埃希菌整合子可变区扩增阳性率为89%,扩增片段大小从0.75kb到2.2kb不等。在Ⅱ类整合酶基因扩增阳性的菌株中,3株可变区扩增阳性,大小均为0.75kb;
4.对Ⅰ类整合子可变区进行序列分析提示其含有:氨基糖苷类抗生素耐药基因(aadA1、aadA5)、磺胺类耐药基因(dfrA1,dfrA17)、氯霉素耐药基因(cmlA)和功能不清的开放阅读框(orfF)。Ⅱ类整合子可变区仅含有aadA基因,编码氨基糖苷类抗生素的耐药性,区别于其他肠杆菌科细菌如沙门、志贺菌中以及霍乱弧菌所检出的Ⅱ类整合子特征;
5.本研究中所检测整合子大部分存在于细菌质粒上,少数存在于细菌染色体上,并有极少数菌株含有2个及以上整合子结构,分别存在于质粒及细菌染色体上。
结论:
1.整合酶基因PCR法是进行整合子检测的可靠而理想的方法,整合子PCR法联合DNA测序技术是进行整合子可变区耐药基因分析的一种快速、较准确的方法;
2.Ⅰ类整合子广泛存在于本地区肠杆菌科细菌中,Ⅱ类整合子检出率低,主要存在于大肠埃希菌中;
3.肠杆菌科细菌对氨基糖苷类、β-内酰胺类和喹诺酮类等抗生素和多重耐药与Ⅰ类整合子的存在明显相关,整合子可作为细菌耐药的一种标记,用于检测细菌耐药情况;
4.整合子可变区主要含有编码对氨基糖苷类和磺胺类抗生素耐药的基因,并含有少量的氯霉素耐药基因和功能不清的开放阅读框,整合子参与了肠杆菌科细菌的耐药和多重耐药;
5.整合子可变区中的耐药基因对细菌耐药性的形成有重要作用,本研究中所检测整合子大部分存在于细菌质粒上,少数存在于细菌染色体上,并有极少数菌株含有2个及以上整合子结构,整合子可变区中的耐药基因对细菌耐药性的形成有重要作用。