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【背景目的】结核病（tuberculosis,TB）仍然是全球最具威胁性的传染病。TB病人对冗长的化疗周期依从性差,会增加疾病复发的风险,并导致耐多药TB（multidrug-resistant TB,MDR-TB）和广泛耐药TB（extensively drug resistant TB,XDR-TB）的出现。迫切需要更有效的TB治疗方法。我们前期研发了一种基于重组复制缺陷的5型腺病毒（recombinant replication-deficiency adenovirus type 5,r Ad5）在细胞内表达颗粒溶素的治疗性疫苗rAdhGLi,通过吸入途径对TB小鼠有显著的治疗作用。我们推测,在假定感染的宿主体内,病原体存在于肺泡巨噬细胞内、外,借助颗粒溶素在细胞内、外表达以及对相应部位的结核分枝杆菌的清除,可能增强TB化疗效果。为此,本研究首次构建了以r Ad5为基础的分泌表达颗粒溶素的治疗性疫苗rAdhGLs,并在小鼠模型中评价了联合rAdhGLi和rAdhGLs对药物敏感性TB和MDR-TB的辅助化疗作用。【方法】1.构建分泌表达颗粒溶素的治疗性疫苗rAdhGLs:rAdhGLs委托禾元生物技术有限公司构建和纯化。用实时荧光定量PCR（q RT-PCR）检测rAdhGLs感染HEK293细胞中颗粒溶素m RNA的表达;Western blotting进一步检测rAdhGLs感染U937和RAW264.7细胞后,上清液中颗粒溶素蛋白的表达。以野生型5型腺病毒Ad Null或rAdhGLi为对照。2.检测rAdhGLs或联合rAdhGLi（r Ads）对细胞增殖和死亡的影响:rAdhGLs或r Ads以MOI值为2000:1或300:1分别感染U937或RAW264.7细胞系,感染0、24、48、72和96 h后,用CCK8试剂盒检测细胞增殖,用Annexin V-APC/7-AAD试剂盒检测细胞凋亡。以培养基或Ad Null为对照。3.体外杀菌效应检测:首先用MDR-TB临床株（No.WPH2016）感染U937或RAW264.7细胞24 h,然后用rAdhGLi或rAdhGLs以MOI值为2000:1或300:1分别处理U937或RAW264.7细胞系96 h。以培养基和Ad Null处理为对照。或者,先用rAdhGLi或rAdhGLs处理细胞72 h,处理结束后收集细胞上清液分别与结核分枝杆菌H37Rv毒株或MDR-TB临床株共孵育24 h。以培养基和Ad Null处理的细胞分泌产物为对照。处理结束后,计数活菌。4.体内直接杀菌效应的检测:用结核分枝杆菌H37Rv毒株滴鼻感染SCID小鼠建立SCID小鼠TB模型。每只小鼠感染量约为200 CFU。分别使用rAdhGLi、rAdhGLs或两者联合（r Ads）经呼吸道吸入治疗1次,两周后,每组处死10只小鼠,检测肺脏和脾脏荷菌量,比较肺组织病理变化,评价治疗效果;为了检测不同腺病毒治疗对小鼠生存的影响,每组另20只小鼠在感染后接受严密监测,每天记录死亡情况,共记录11周,绘制生存曲线。5.对药物敏感性TB的辅助治疗效应检测:C57BL/6小鼠感染结核分枝杆菌H37Rv毒株18天后,使用rAdhGLi、rAdhGLs和r Ads或联合化疗分别治疗2、4、6个月,评价辅助治疗效果;并在每个治疗时间点结束后,继续饲养3个月,不作任何治疗,观察有无疾病复发发生,评价预后。6.对MDR-TB的辅助治疗效应检测:C57BL/6小鼠感染MDR-TB临床株15天后,使用rAdhGLi、rAdhGLs和r Ads或联合化疗分别治疗15、30或60天,评价辅助治疗效果。【结果】1.rAdhGLs的构建:q RT-PCR证实rAdhGLs和rAdhGLi感染的HEK293细胞中颗粒溶素m RNA水平明显高于Ad Null对照组,表明rAdhGLs可以在受感染细胞中表达颗粒溶素;Western blotting证实在rAdhGLs处理的U937或RAW264.7细胞的上清液中检测到重组颗粒溶素蛋白（9 k Da）,进一步证实其分泌表达了颗粒溶素。2.rAdhGLs和rAdhGLi（r Ads）联合对U937和RAW264.7细胞株的增殖和死亡的影响:在不同的时间点,rAdhGLs或r Ads对U937和RAW264.7细胞增殖的影响与对照组（培养基或Ad Null处理）相比,无明显统计学差异。同样的,rAdhGLs或r Ads处理U937和RAW264.7细胞后,在所有时间点,其细胞凋亡率和坏死率与对照组相比也无明显差异。3.rAdhGLs或rAdhGLi对药物敏感性和耐多药结核分枝杆菌的体外杀菌作用:rAdhGLi显著抑制U937和RAW264.7细胞内MDR-TB临床株的生长。rAdhGLs不能抑制细胞内结核分枝杆菌的生长,而rAdhGLs处理的U937和RAW264.7细胞上清液对结核分枝杆菌H37Rv或MDR-TB株生长具有明显的剂量依赖性抑制作用。4.rAds联合应用对感染结核分枝杆菌的SCID小鼠的直接杀菌作用:在结核分枝杆菌H37Rv感染的SCID小鼠模型中,与PBS或Ad Null对照组相比,单用rAdhGLi或rAdhGLs治疗能显著降低脏器荷菌量。更重要的是,在所有组中,rAdhGLs和rAdhGLi联合应用提供了最强的治疗效果,比单用rAdhGLi或rAdhGLs治疗延长了小鼠生存期。5.rAds联合应用可缩短药物敏感性TB的化疗时间:单用药物治疗4个月后,小鼠脏器培养呈阴性,但在治疗结束的3个月后这些小鼠肺脏全部转阳。而不同r Ads免疫治疗联合化疗在治疗4个月时就已完全清除了两个器官中的结核分枝杆菌,所有小鼠的肺脏和脾脏未发生培养转阳。6.rAds联合应用是MDR-TB化疗的有效辅助手段:与PBS或Ad Null对照组相比,单用rAdhGLi或rAdhGLs能显著降低脏器荷菌量。r Ads联合治疗30天后,小鼠肺脏和脾脏的荷菌量比单用rAdhGLi或rAdhGLs治疗低。更重要的是,rAdhGLi和/或rAdhGLs联合药物的治疗效果优于其单用的效果。最重要的是,联合应用r Ads和药物在所有组中显示出最强的治疗效果。【结论】重组腺病毒将颗粒溶素运输到感染的肺部,辅助化疗可增强和加快体内清除TB,有望成为TB和MDR-TB的辅助治疗性疫苗。【背景目的】卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin,BCG）是唯一获得许可的预防儿童结核病（tuberculosis,TB）的疫苗,但它不能为成人提供有效的保护。我们前期的研究表明,一种由新型脂质体佐剂DMT和多阶段抗原CMFO乳化的新型候选疫苗CMFO/DMT,可以保护小鼠抵抗原发性进行性TB、潜伏感染和TB再激活。为了研发更有效的成人TB亚单位疫苗,我们假设构成亚单位疫苗的佐剂是影响亚单位疫苗预防成人TB效果的决定性因素。因此,我们拟进一步了解脂质体佐剂DMT中的模式识别受体（pattern recognition receptor,PRR）激动剂,单磷酰脂质A（Monophosphoryl lipid-A,MPLA）和海藻糖（Trehalose-6,6-dibehenate,TDB）在CMFO亚单位疫苗诱导保护性中的作用。本研究中,我们以二甲基双十八烷基铵（Dimethyldioctadecylammonium,DDA）脂质体为基础制备了不同成分的脂质体佐剂DDA、DDA/MPLA（DM）、DDA/TDB（DT）和（DDA/MPLA/TDB）DMT,然后比较了不同脂质体佐剂乳化的CMFO亚单位疫苗在C57BL/6小鼠模型中的免疫原性和保护效果。【方法】1.脂质体佐剂及疫苗的制备:薄膜水化法制备不同成分的脂质体佐剂DDA、DM、DT和DMT;用金属螯合亲和层析纯化制备CMFO蛋白,调整蛋白浓度为0.2 mg/m L。将蛋白溶液和佐剂等体积混合,即得到不同佐剂乳化的亚单位疫苗（200μL含有10μg CMFO蛋白）。制备不同的佐剂和疫苗各三批次,分别检测粒径、多分散系数（polydispersity index,PDI）和zeta电位等理化性质。透射电子显微镜观察脂质体形态。2.小鼠免疫:选用SPF级6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠,随机分成10组。其中佐剂对照组、疫苗组,分别于背部皮下接种两次（200μL/次）,间隔3周;阳性对照组,BCG疫苗背部皮下接种一次（106 CFU/200μL）;阴性对照组,采用PBS免疫两次（200μL/次）,间隔3周。3.抗TB原发感染短期和长期保护性评价:初次免疫后的第10周和第20周,用结核分枝杆菌H37Rv毒株滴鼻感染各组小鼠。每只小鼠感染量约为100CFU。感染四周后,分别通过比较脾脏和肺脏的荷菌量、肺组织病理学变化来评估不同佐剂乳化的CMFO亚单位疫苗组的短期和长期保护效果。4.暴露前免疫机制分析:初免后9周,收集各组血清,ELISA检测各组小鼠血清中CMFO特异性Ig G、Ig G1和Ig G2a抗体效价;CBA技术检测各组小鼠脾细胞分泌的Th1、Th2和Th17型细胞因子水平;流式细胞术检测各组小鼠脾脏、肺脏CMFO特异性效应和中枢记忆性T细胞水平。5.感染后免疫机制分析:初免后9周,用结核分枝杆菌H37Rv毒株滴鼻感染各组小鼠。感染4周后,CBA技术检测各组小鼠脾细胞分泌的Th1、Th2和Th17型细胞因子水平;流式细胞术检测各组小鼠脾脏、肺脏CMFO特异性效应和中枢记忆性T细胞水平。【结果】1.不同脂质体及其乳化的亚单位疫苗的理化性质分析:所有脂质体在微米范围内呈近似球形的囊泡。在DDA脂质体中加入TDB和/或MPLA不会导致粒径和PDI的变化,而在加入MPLA后会导致脂质体表面电荷的显著降低。抗原CMFO与不同脂质体乳化后,均导致粒径和PDI增大,zeta电位降低。然而,所有的CMFO蛋白-脂质体复合物仍保持正电荷。2.不同脂质体佐剂乳化的亚单位疫苗的短期和长期保护效应:CMFO/DMT疫苗的短期和长期保护效果与BCG疫苗相当。与CMFO/DDA和CMFO/DT相比,CMFO/DMT可提供更强和更持久的抗结核分枝杆菌感染的保护效果。此外,CMFO/DM在肺脏中提供了与CMFO/DMT相当的抗结核分枝杆菌感染的保护效果。3.脂质体佐剂亚单位疫苗诱导的抗体反应:初免9周后,与CMFO/DDA相比,CMFO/DMT诱导产生了更高水平的CMFO特异性Ig G、Ig G2a和Ig G1,而CMFO/DM也诱导产生了更强的抗CMFO Ig G和Ig G2a反应。CMFO/DM、CMFO/DT和CMFO/DMT诱导的抗体反应相似。4.脂质体佐剂亚单位疫苗免疫小鼠脾细胞分泌细胞因子水平:无论是暴露前还是感染后,与CMFO/DDA相比,CMFO/DM或CMFO/DT诱导产生了更高水平的IFN-γ、IL-2、IL-17A和TNF-α。值得注意的是,在所有组中,CMFO/DMT诱导产生最高水平的IFN-γ、IL-2、IL-17A和TNF-α。而CMFO/DT诱导产生最高水平的IL-10。5.脾脏T细胞反应的差异:暴露前,所有免疫小鼠脾脏以CMFO特异性IFN-γ+CD4+T细胞和IFN-γ+CD4+TEM细胞为主。CMFO/DMT免疫小鼠的脾脏产生了最高水平的IFN-γ+或IL-2+CD4+T细胞、IFN-γ+CD4+TEM细胞和IL-2+CD4+TCM细胞。与CMFO/DDA组相比,CMFO/DM小鼠脾脏产生的IL-2+CD4+T细胞和IL-2+TCM细胞增多,而CMFO/DT诱导产生更多的IFN-γ+或IL-2+CD4+T细胞和IFN-γ+CD4+TEM细胞。更重要的是,DM和DMT佐剂乳化的CMFO疫苗组均比CMFO/DDA或CMFO/DT诱导产生更多的IL-2+CD8+TCM细胞。感染后,在所有组中脾脏T细胞反应均以IL-2+CD4+T细胞或TCM细胞占主导地位。CMFO/DMT诱导产生最高水平的CMFO特异性IFN-γ+T细胞、IFN-γ+CD4+TEM细胞、IL-2+CD4+T细胞或TCM细胞。与CMFO/DDA组相比,CMFO/DM诱导更多的IFN-γ+CD4+TEM细胞、IL-2+CD4+T细胞和IL-2+CD4+TCM细胞产生,而CMFO/DT诱导更多的IFN-γ+T细胞、IFN-γ+CD4+TEM细胞、IL-2+CD8+T细胞和IL-2+TCM细胞产生。6.肺脏T细胞反应的差异:暴露前,所有免疫小鼠肺脏以IL-2+CD4+T细胞占主要地位。然而,各组肺脏中CMFO特异性IFN-γ+T细胞或TEM细胞、IL-2+CD8+T细胞或IL-2+TCM细胞数量较低,均少于104个。感染后,所有疫苗组的肺脏以IL-2+CD4+T细胞或TCM细胞为主。CMFO/DMT诱导小鼠肺脏产生了最高水平的IFN-γ+或IL-2+CD4+T细胞、IFN-γ+TEM细胞和IL-2+CD4+TCM细胞。与CMFO/DDA组相比,CMFO/DM诱导肺脏产生了更多的IFN-γ+或IL-2+T细胞、IFN-γ+CD4+TEM细胞和IL-2+TCM细胞,而CMFO/DT诱导产生更多的IFN-γ+或IL-2+CD8+T细胞、IFN-γ+CD4+TEM细胞和IL-2+TCM细胞。【结论】佐剂DMT的成分MPLA和TDB具有协同作用,有助于增强CMFO/DMT疫苗对原发性进行性TB的免疫原性和长期保护效应,本研究进一步拓展了CMFO/DMT疫苗的研究进展。鉴于佐剂在疫苗诱导保护中的重要作用,不同的PRR激动剂的组合策略可能是下一代TB疫苗值得进一步研究的方向。