反应型次氯酸荧光探针的合成和应用

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在过去20年中,荧光技术在生物化学和生物物理学中的应用都得到了突飞猛进的发展。现如今荧光成像技术已经成为了一种方法学而被广泛应用于生物技术,流式细胞术,疾病的诊断,DNA的测序、鉴定及基因的分析等领域。次氯酸(HClO/ClO-)是一种重要的活性氧物种,细胞在正常环境下产生内源性次氯酸能够杀灭外来的细菌和病原体。然而,次氯酸的过量产生,会导致细胞内生物分子的非正常氧化,并引起组织的损伤和一系列疾病的发生等。因此,能够快速选择性监测生物样本中次氯酸浓度变化的荧光探针的开发设计,越来越受到关注。本论文中以次氯酸在环境和生物细胞中的检测为目的,荧光检测为手段,综合运用分子识别和分子荧光传感的原理设计合成了两例次氯酸荧光探针。以N-杂香豆素为荧光染料母体引入识别基团1,8-二萘胺,基于缩醛胺氧化机理,设计合成了一例"off-on"型次氯酸荧光探针AC-CIO,探针分子本身由于PET效应不发射荧光,当与次氯酸作用之后,识别基团部分被氧化,PET效应被抑制,在576 nn处发射出强烈的荧光,反应较迅速(2分钟内达到饱和),选择性好,最低检测限低(25 nM),而且随着次氯酸浓度的增大,溶液颜色由粉红色逐渐变为淡黄色,能够实现可视化检测。荧光共聚焦成像实验表明探针AC-ClO能够用于检测细胞内源和外源性次氯酸,而且随着刺激物浓度的增大,细胞内荧光强度不断增大。我们将吡咯基团引入BODIPY荧光母体的3位,使之形成一个更大的π-π共轭体系,基于吡咯氧化机理,设计合成了一例比率型次氯酸荧光探针BRCIO.当与次氯酸反应后,吡咯基团中的N原子被氧化为N-O配合物的形式,破坏了吡咯基团与BODIPY母体的共轭,使荧光发射波长由585 nm处蓝移到505nm,二者形成很好的线性关系。且反应前后有177倍的比率荧光增强,反应相当迅速,几乎瞬间达到饱和(1 s内),对其他活性氧有较好的选择性。根据荧光共聚焦成像实验我们还发现探针分子BRCIO能够对细胞内次氯酸进行成像,而且反应前后信号实现很好的分离,反应前探针本身主要定位在细胞质区域,而与次氯酸反应后的产物主要定位于细胞膜上。同时探针分子BRCIO还可以用于试纸中次氯酸的检测。
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