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幽门螺杆菌（H.pylori）是人类最常见的致病菌，我国普通人群的感染率为50%~80%，每年新增感染人数近千万。H.pylori感染不但与B型胃炎、消化性溃疡、MALT淋巴瘤、胃癌的发生有密切关系，而且与胃肠外疾病的发生也有重要关系，故已被世界卫生组织国际癌症研究机构列入第一类致癌原，并已在动物模型中得到了证实。根除H.pylori感染目前采取的方式很多：如药物的二联、三联以及四联疗法，取得了一定的疗效，但近年来，由于广泛、大剂量抗生素应用，导致了H.pylori耐药菌株的产生；同时出现了一些药物的副作用；而且患者耐受性、依从性以及承受力都受到了挑战。鉴于此，欲求降低H.pylori感染率及其相应疾病的发生率，不少研究工作者正致力于开发研究新的H.pylori感染的治疗以及预防方案。新近研究表明：H.pylori的尿素酶、热休克蛋白A（HspA）、中性粒细胞激活蛋白、粘附素、细胞空泡毒素、细胞毒素相关A蛋白和Mr为18 000、26 000的H.pylori OMP均是有效的抗原成分。而HspA和Mr为18 000、26 000的OMP为所有的H.pylori共同的抗原成分，以HspA为抗原的疫苗可使70%~80%试验小鼠获得保护。为了克服单种抗原免疫原性弱的缺点而获得较好的免疫效果，有学者建议多种抗原成分联合起来制作疫苗。因此本实验利用基因克隆技术，将HspA和Mr为18 000、26 000的OMP编码基因，进行PCR扩增，构建单价、双价抗原侯选疫苗重组载体，并在E. coli中进行表达，对其抗原性进行研究；同<WP=9>时构建针对Mr为18 000、26 000的OMP单克隆杂交瘤细胞株以及以Mr 18 000、26 000的OMP为抗原的胶体金试纸，为H.pylori疫苗、快速诊断试剂盒的制备以及其在临床上的应用奠定基础。第一部分 H. pylori OMP编码基因的克隆、表达以及抗原性的研究 目的 分别构建含H. pylori18kDa、26kDa OMP编码基因的重组载体，并在原核表达菌BL21、DH5a E. coli中表达。为进一步研究H. pylori的疫苗、快速诊断试剂盒及其临床应用奠定基础。方法 用PCR方法从H. pylori染色体DNA中，扩增18kDa、26kDa OMP编码基因片段，经BamH I、Hind Ⅲ 双酶切、纯化后，将目的基因分别与同样进行酶切的质粒pET32a(+)、pQE30在T4连接酶的作用下连接，转化含有目的基因的重组载体，同时用PCR等方法鉴定重组载体。以含目的基因片段的重组载体分别转化大肠杆菌BL21（DE30）、DH5a并诱导表达，用镍离子柱进行纯化。经SDS-PAGE分析其表达产物含量以及纯化程度，用ELISA方法以及免疫BALB/c 小鼠，检测其抗原性。结果 经酶切、测序分析表明，插入的基因片段为H. pylori18kDa、26kDa OMP编码基因，与Tomb等报道相比较： H. pylori 18kDa OMP编码基因中，有2.08 %编码基因发生变异，导致1.70%氨基酸残基发生改变；而H. pylori 26kDa OMP编码基因中有1.01% 碱基发生变异，导致1.51%的氨基酸残基改变。经SDS-PAGE分析发现，重组质粒pET32a(+)/528、pET32a(+)/594表达的融合蛋白相对分子质量（Mr）分别为：38×103、46×103，其中pET32a（+）表达的蛋白Mr约为20×103；而重组质粒pQE30/528、pQE30/594表达的目的蛋白分别为18×103、26×103。4种重组载体pET32a(+)/528、pET32a(+)/594、pQE30/528、pQE30/594经诱导表达，其可溶性产物分别占菌体蛋白的21.30%、38.96%、17.30%、25.30%，重组蛋白经Ni2+-NTA琼脂糖树脂纯化后，其纯度都高达95%以上。ELISA方法检测显示，上述重组表达蛋白可被H. pylori阳性患者血清以及用重组蛋白免疫的动物血清所识别，同时免疫的BALB/c小鼠具有抗H. pylori<WP=10>感染的能力，证明具有良好的抗原性。结论 成功地克隆和构建了H. pylori18kDa、26kDa OMP编码基因的重组载体pET32a(+)/528、pET32a(+)/594、pQE30/528、pQE30/594，并在原核表达细菌中表达，其抗原性良好，为蛋白质疫苗的研制和快速诊断试剂盒等的制备奠定了基础。关键词 幽门螺杆菌;外膜蛋白(OMP)基因;原核表达;抗原性