病毒(包括噬菌体)是深海环境中丰度最大和多样性最高的生物种类,它们直接或间接影响着细菌和古菌的生命活动,并且在这种营养匮乏的环境中起着关键的生态调节者的作用。目前深海噬菌体的研究主要集中在生态调查的阶段,由于模式噬菌体-宿主系统的缺乏,深海噬菌体的基因表达调控方式及其与宿主的相互作用关系等科学问题尚未阐明。有研究表明,丝杆状噬菌体是深海深部沉积物中活跃的优势类群。本实验室2007年从来源于西太平洋1914米沉积物的深海细菌Shewanella piezotolerans WP3中分离到目前唯一的一株低温诱导丝状噬菌体SW1。SW1的低温诱导不依赖于经典的SOS途径,但具体的分子调控机制尚未解析。在本研究中,我们首先鉴定了SW1自身编码的转录调节因子FpsR对噬菌体基因表达的调控作用。fpsR基因缺失会导致包括自身在内的噬菌体基因显著上调,进而导致在20℃下噬菌体也能被诱导,产生单链的噬菌体基因组DNA。FpsR以同源四聚体的形式发挥作用,蛋白N端为DNA结合结构域,蛋白C端的两股α螺旋负责稳定多聚体,C端的缺失会使得FpsR丧失调控功能。凝胶阻滞实验和DNase I Foot-printing实验证明FpsR只在SW1结构基因操纵子的启动子区域具有三个结合位点,不能结合到自身的启动子区域,但是由于噬菌体SW1启动子反向交叉的排列方式使得FpsR可以实现对自身的反馈抑制。生物膜干涉实验结果显示FpsR能够与三个结合位点独立结合,且低温下FpsR结合DNA的能力会下降。与对照菌株相比,低温(4℃)下fpsR缺失突变体中噬菌体SW1基因仍然显著上调,表明除了FpsR之外还有其他蛋白参与SW1的低温诱导调控。我们发现,H-NS是宿主Shewanella piezotolerans WP3中对噬菌体SW1基因表达调控的关键转录因子。hns基因缺失会导致噬菌体fpsA等结构基因表达上调,调控蛋白fpsR基因表达下调。体外实验表明,H-NS能够与fpsA、fpsR的启动子区域直接结合发挥调控作用,并且分别具有一个结合位点。低温会导致H-NS与噬菌体启动子区域的亲和能力显著下降。此外,H-NS在噬菌体复制过程中也发挥重要作用,hns基因缺失会导致噬菌体复制缺陷。在fpsR、hns缺失的双突变体中,SW1基因表达的低温诱导效应明显减弱,低温下SW1基因的转录强度只增加了10%。据此,我们构建了以FpsR和H-NS为核心调控因子的噬菌体SW1低温诱导调控分子模型。利用新解析的噬菌体SW1基因调控模型,系统研究了硫修饰对于噬菌体基因表达调控的影响。DNA磷硫酰化修饰是指在天然DNA骨架上发现的P-O键被P-S键替换的化学修饰,属于首例DNA骨架上的生理修饰,由DndA-E实现。DNA硫修饰在细菌界分布广泛,但是独立存在的硫修饰系统的生理学功能一直没有被阐明,特别是硫修饰是否能够参与基因表达调控没有定论。噬菌体SW1的基因表达调控区域具有8个潜在的硫修饰识别位点。经过硫修饰以后,SW1的结构蛋白基因fpsA、fpsB表达显著上调,调控蛋白基因fpsR表达显著下调,表明硫修饰对噬菌体SW1基因的抑制和促进调控都产生影响。在对调控区域的硫修饰位点进行突变后,SW1的基因表达在有/无硫修饰系统的菌株中不再具有显著性差异。在对主要抑制蛋白基因fpsR进行缺失后,硫修饰对噬菌体SW1抑制调控的影响表型消失,fpsA以及fpsB的表达在有/无硫修饰系统的菌株中不具有显著性差异,但是硫修饰对于fpsR促进调控的影响依然存在,fpsR的转录水平显著低于对照菌株。总之,硫修饰干扰了噬菌体SW1原有的基因表达调控,进而导致SW1在20℃也被诱导,ssDNA形式的噬菌体基因组在细胞中被检测到。凝胶阻滞实验以及ITC实验证明硫修饰能够降低FpsR与DNA的结合能力。除了噬菌体本身以外,我们还研究了硫修饰对宿主细胞的生理影响。在Shewanella piezotolerans WP3中导入硫修饰系统,能够明显提升其在紫外、X射线、低温、低盐、高压、重金属的环境胁迫下的生长,然而在高盐、酸、碱、过氧化氢以及抗生素胁迫条件下硫修饰菌株与对照菌株的生长没有显著性差异,在高温条件下硫修饰菌株表现出了明显的生长缺陷。在一株过氧化物酶系功能缺失的大肠杆菌突变株Hpx~—中导入硫修饰系统,能够明显提升微生物在紫外、X射线、过氧化氢、低温、高温、低盐、高盐、高压、酸、碱、重金属的环境胁迫下的生存和适应能力,只是在抗生素胁迫条件下硫修饰菌株没有明显的生长优势。在不同胁迫条件下硫修饰基因的表达量相对恒定,氧化监测探针结果及过氧化氢清除实验证明了硫修饰在胞内发挥抗氧化的作用。我们还证实,WP3硫修饰菌株高温胁迫下生长缺陷是由于硫修饰干扰了热激蛋白原有的诱导调控,使得其表达量显著不足,从而导致了菌株的生长缺陷。对硫修饰菌株16S rRNA基因的系统发育分析表明,只具有硫修饰的菌株比具有硫修饰限制修饰系统的菌株分布更广泛并处于起源更早的分支中,提示硫修饰最早作为一种抗氧化系统起源,后来在进化传播的过程中与一套限制系统偶联进而构成了一套全新限制修饰系统。