论文部分内容阅读
目的:探讨生理性拉应力通过Nell-1/Ihh信号对小鼠软骨细胞分化的影响,进而明确拉应力通过机械力信号的生物转导调控软骨细胞分化的相关机制,以期为临床上寻找快速、高效促进颞下颌关节改建及下颌骨生长的方法提供理论依据。方法:1.体外培养小鼠软骨细胞系ATDC5,将细胞接种于79 mm×40 mm×1.38 mm的细胞应变片上,应用四点弯曲细胞力学加载仪对细胞施加生理性拉应力。加力组设置加力力值为2000μstrain,加力时间为2 h,相当于细胞发生0.2%的形变量,同时设置未加力细胞作为对照组。采用实时荧光定量PCR检测软骨分化相关基因（Col-2、Col-10、Aggrecan、Sox9、VEGF）和增殖相关标志物PCNA的表达情况。2.将出生21天的B6雄性小鼠12只随机分为前导组和对照组（n=6）。前导组:每3天剪短1 mm下前牙,促使小鼠下颌前伸,并配合正常饮食,下颌前导2周,对照组:未进行任何处置,饲养条件相同。通过HE染色进行髁突形态学观察,通过micro CT进行下颌骨及髁突线性数据测量。3.通过对ATDC5细胞施加2000μstrain/不同时间（0、1、2和4 h）和不同力值（0、1000、2000和3000μstrain）/2 h的拉应力,采用实时荧光定量PCR检测Nell-1、Runx2、Ihh、Ptch-1、Gli-1和Hhip-1基因的表达情况,采用western blotting检测Runx2、Nell-1和Ihh的表达水平。4.采用免疫组织化学验证前导组和对照组小鼠髁突Nell-1和Ihh的表达情况。5.对ATDC5细胞使用Ihh信号通路抑制剂环巴胺（10μM）进行预处理,施加2000μstrain/2 h的拉应力后,采用实时荧光定量PCR检测Nell-1、Ihh、Ptch-1、Gli-1和Hhip-1的基因表达情况,采用western blotting检测Nell-1和Ihh的表达水平。结果:1.在生理性拉应力刺激下,与对照组相比,加力组的软骨分化标志物（Col-2、Col-10、Aggrecan、Sox9、VEGF）和增殖相关标志物PCNA的表达均明显上升（P＜0.01）。2.小鼠下颌前导2周,HE结果显示,与对照组相比,前导组髁突的软骨全层厚度明显增加（P＜0.01）。micro CT结果显示,下颌前伸能有效促进小鼠下颌升支增长量,下颌长度增长量和髁突长度增长量的变化。（P＜0.01）。但对髁突前后径、内外径增长量和骨矿化密度增长没有统计学差异（P＞0.05）。3.对ATDC5细胞施加2000μstrain/不同时间（0、1、2和4 h）和不同力值（0、1000、2000和3000μstrain）/2 h拉应力,与对照组相比,各组Runx2、Nell-1、Ihh、Ptch-1、Gli-1和Hhip-1的表达均明显上升（P＜0.01）。Runx2的基因表达水平随加力时间的延长或力值的增长而逐渐上升（P＜0.01）,但Nell-1、Ihh、Ptch-1、Gli-1和Hhip-1的基因表达水平则在早期逐渐升高,在条件为2000μstrain/2 h时达到最高,随后出现回落但仍明显高于对照组（P＜0.01）。4.免疫组织化学显示,对照组与前导组的髁突均有Nell-1和Ihh的阳性表达。与对照组相比,前导组髁突中Nell-1、Ihh的表达增多（P＜0.05）。5.当Ihh信号通路受到环巴胺的抑制后,Ihh、Ptch-1、Gli-1和Hhip-1的基因表达水平与对照组相比均明显降低（P＜0.01）,Nell-1的表达水平与对照组相比无统计学差异（P＞0.05）。对经过预处理的软骨细胞加力后,Nell-1、Ihh、Ptch-1、Gli-1和Hhip-1的表达水平均明显上升（P＜0.01）。结论:1.生理性拉应力可以促进软骨细胞的增殖分化。2.Nell-1可以对拉应力产生应答,产生时间依赖性和力值依赖性。3.Nell-1位于Ihh信号通路的上游,且在拉应力刺激下Nell-1激活Ihh信号通路,从而调控软骨细胞的分化。