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朊蛋白(Prion protein)是动物传染性海绵状脑病的致病蛋白,是由prnp基因编码的一种糖蛋白。牛的传染性海绵状脑病(BSE)俗称疯牛病,是一种严重危害人类健康和世界经济发展的传染性疾病。大量研究表明,该病的病原体是PrPsc—一种内源性膜锚定蛋白PrPc(由prnp基因编码)的异构体,其发病过程中的主要事件就是PrPsc诱导的PrPc向PrPsc的转化(秦玉昌和吕小文2006)。因此,科学家推断PrPc缺失的动物因缺乏转化的底物而可能具有抵抗Prion病的能力,应用基因工程技术生产对疯牛病具有抵抗能力的“超级牛”成为研究的一个最大热点。利用基因打靶技术生产转基因动物的关键是打靶载体的构建。在哺乳动物中,随机重组的频率远远高于同源重组的频率(杨晓等2003),因此,为了提高打靶效率,在构建载体时要考虑利用有效的基因打靶筛选策略。正负筛选策略( PNS)是目前应用较广泛的一种策略,基于此,本研究利用Cre-Loxp重组系统的原理,以通用型打靶载体PA2T为骨架构建牛朊蛋白基因prnp敲除载体PBONP,用电穿孔的方法转染牛胎儿成纤维细胞,经正负双向筛选来获得药物坑性细胞克隆,然后这些药物抗性细胞经过PCR试验、免疫荧光试验、western blotting试验的鉴定,最终得到了基因打靶的阳性细胞。结果如下:1.通过PCR技术成功的从牛的全血基因组中扩增出prnp基因两个同源臂,长度分别为1727bp和3860bp。测序结果表明,克隆出的同源短臂、同源长臂的序列与GeneBank上公布的基因序列一致。2.以通用型打靶载体PA2T为基本骨架,将牛prnp基因的长短同源臂导入其中,成功构建了牛朊蛋白基因敲除载体PBONP。3.确立了G418和GCV的最小细胞致死浓度和维持浓度,G418的致死浓度和维持浓度分别为600μg/ml和300μg/ml,GCV的最小致死浓度和维持浓度分别为200 nmol/ml和100 nmol/ml。4.利用电穿孔法将打靶载体PBONP转染牛胎儿成纤维细胞,经过G418和GCV的正负筛选,最后得到176个药物抗性的细胞克隆。通过PCR、间接免疫荧光和Western blotting试验的多次鉴定,确定了176个药物抗性细胞克隆中有9个是阳性细胞克隆。