论文部分内容阅读
为了利用植物蛋白资源，使湿法生产淀粉的副产物——玉米黄粉增值，本文采用正交试验研究了从黄粉中提取玉米蛋白及用中性蛋白酶（Nutrase）、碱性蛋白酶（Alcalase）酶解玉米蛋白，制备玉米醒酒肽的条件；进一步采用超滤、配位色谱法、RP-HPLC、氨基酸分析仪等手段对玉米肽进行了分离及成分分析。通过体外抗羟基自由基试验、激活乙醇脱氢酶（ADH）活性试验及动物试验考察醒酒肽对小鼠血清中乙醇浓度的影响，结合玉米肽对D-氨基半乳糖（D-Gal）及乙醇诱导急性肝损伤模型鼠的保护作用研究，初步探讨了玉米肽的醒酒保肝作用机制；比较了玉米肽和玉米蛋白的功能性质，对玉米肽进行了脱苦研究，并用体外激活ADH活性试验比较了几种脱苦方法对玉米肽醒酒活性的影响。结果如下：1．提取正交试验表明：以粗蛋白含量为56.97％玉米黄粉为原料，优化提取玉米蛋白条件，其最佳条件为：提取液（由0.1mol／LNaOH与95％乙醇配制）碱醇比为45／55（v／v），料液比1：15，提取时间2h，温度55℃；在最佳提取条件下，提取物中粗蛋白含量提高到93.14％。2．玉米肽醒酒作用机理研究（1）酶解正交试验表明：用中性蛋白酶酶解玉米蛋白，当料液比为1：25，酶底比为1.5％，酶解时间为2h时，酶解所得玉米肽对ADH的激活率最高为35.75％，对·OH的抑制率为61.54％，肽回收率为20.31％；用碱性蛋白酶酶解玉米蛋白，当料液比为1：25，酶底比为0.5％，酶解时间为4h时，酶解所得玉米肽对ADH的激活率为最高为27.26％，对·OH的抑制率为59.58％，肽回收率可达82.06％。前者虽有较高的ADH激活率，但其肽回收率过低。（2）动物试验表明：灌胃中性蛋白酶低水解度肽（2h、酶底比0.5％、料液比1：25）能使小鼠血醇浓度降低54.06％（极显著降低，p＜0.001），但该肽的回收率过低（19.97％）；灌胃碱性蛋白酶中水解度肽（4h、酶底比0.5％、料液比1：20）的醒酒活性高，并存在剂量效应关系，当灌胃剂量为800 mg／kg·bw时，小鼠血醇浓度降低了62.80％（极显著降低，p＜0.001），且该粗肽的回收率高（82.01％）；碱性蛋白酶的中水解度肽具有开发价值。（3）动物试验与体外试验结果基本吻合，即中性蛋白酶低水解度肽和碱性蛋白酶中水解度肽醒酒效果好，说明并非水解度越高，醒酒活性越好；同时也说明用体外激活ADH活性试验和抑制·OH试验，筛选高醒酒活性玉米肽是便捷可行的方法。（4）以对ADH的激活率和对·OH抑制率为活性跟踪指标，将碱性蛋白酶酶解玉米粗肽（crude corn peptides，CCP）过分子量为6000u的超滤膜，得到高活性玉米肽（corn peptides，CP），CP对·OH抑制率高于CCP，前者为76.96％，后者为50.50％；而CCP对ADH的激活率高于CP，前者为30.69％，后者为26.18％；采用Cu2+-SephadexG-25配位色谱法分离CP，得CPⅠ、CPⅡ和CAA。三者中以CPⅡ对·OH抑制率及对ADH的激活率最高，分别为61.91％和28.85％。（5）氨基酸分析结果显示：玉米肽中丙氨酸、亮氨酸含量高，尤其是亮氨酸含量；CP、CPⅠ、CPⅡ具有高F值。（6）本文实验结果提示：玉米肽的醒酒作用机制之一是通过激活胃ADH，加强乙醇在胃肠道的首过代谢，有胃肠吸收抑制剂的作用；其醒酒作用机制之二是通过激活肝脏ADH，增强乙醇的代谢，即有代谢增强剂的作用；其醒酒作用机制之三是可通过提高丙氨酸、亮氨酸的浓度，产生稳定的辅酶（NAD+），抑制血液中乙醇浓度的升高。3．碱性蛋白酶酶解CCP对小鼠化学性肝损伤的保护作用（1）CCP对D-Gal引起的小鼠急性肝损伤有保护作用，且呈剂量——效应关系。与D-Gal肝损伤模型组小鼠比较，当CCP灌胃剂量为800 mg／kg·bw时，能极显著（p＜0.01）降低小鼠血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）活性和甘油三酯（TG）含量，同时也能极显著（p＜0.01）地抑制还原型谷胱甘肽（GSH）含量的下降；病理学观察也显示出明显的剂量——效应关系，高剂量给肽组小鼠肝细胞病变明显好转或恢复。（2）CCP对乙醇引起的小鼠急性肝损伤有保护作用，生化指标呈剂量——效应关系。与小鼠乙醇肝损伤模型组比较，灌胃CCP 200mg／kg·bw、400mg／kg·bw、800mg／kg·bw时，均能极显著地抑制小鼠血清中GSH含量的下降；灌胃CCP800mg／kg·bw时，可极显著降低TG的含量、显著抑制MDA的产生；肝组织病理学观察显示，高剂量给肽组小鼠肝细胞与正常组小鼠肝细胞基本相同；但从组织形态学来说，该模型组鼠肝损伤程度及脂肪变性程度均不及D-Gal模型组明显，这与乙醇的毒性不及D-Gal有关。（3）本文实验结果提示：玉米肽的保肝机制之一是其具有良好的抑制自由基的能力；保肝机制之二是其能激活ADH的酶活，增强乙醇的胃肠首过代谢；从而减轻自由基、高浓度乙醇对肝脏造成的损伤；保肝机制之三是具有高F值，可以纠正急性肝损伤模型鼠血浆及脑中的氨基酸病态模式。4．碱性蛋白酶酶解CCP的应用研究（1）和玉米蛋白相比，玉米肽的溶解度大大提高，尤其是在等电点，在不同pH值下溶解度均在90％以上；起泡性和乳化性都得到很大程度的提高；黏度降低，流动性好。（2）分别利用活性炭、风味酶和β-环状糊精三种方法对玉米肽进行脱苦，并考察了脱苦对醒酒活性的影响，三种脱苦方法各有利弊，应用于具体的食品中时要综合考虑。（3）制作了两款风味不同的醒酒保肝活性肽饮料，即玉米原味饮料和嗜好型咖啡味饮料，均适于用作宴席上饮酒前的茶点。