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本论文包括“Ⅰ大豆微卫星突变的分子分析及重要性状突变基因的SSR标记”和“Ⅱ硝态氮和铵态氮对大豆硝酸还原酶基因的表达调控研究”两部分。
Ⅰ大豆微卫星突变的分子分析及重要性状突变基因的SSR标记
微卫星或SSR标记是进行植物基因组研究、基因型鉴定和分子辅助育种的一种有效工具。大豆是重要的经济和油料作物，叶形和每荚粒数是与大豆籽粒产量相关的重要性状。本实验以“窄叶(NL)”和“4-粒荚(4SP)”大豆突变体E182、亲本品种LD4(表现卵圆叶和无4-粒荚)以及二者后代分离群体、近等基因系为材料，通过微卫星标记和克隆测序等技术，鉴定突变体基因组的微卫星变异并分析其分子机制。同时在对“窄叶”和“4-粒荚”突变基因进行遗传分析的基础上鉴定它们的微卫星标记，为大豆产量性状的分子改良奠定基础。取得了下列主要结果：
1、用550对SSR引物在突变体与其亲本基因组之间扩增筛选出16个微卫星座位发生重复长度变异。序列分析显示，除Satt491测序未成功以外，其余15个微卫星座位只检测到2-碱基和3-碱基两种重复单位的变异。其中，有5个变异座位(Satt282，Satt483，Satt579，Satt600，Satt602)的重复序列区分别缺失了1、3、8、20和1个3-碱基重复，它们的等位基因长度分别减少了3、9、24、60和3个碱基对；另10个微卫星座位(Satt005，Satt117，Satt185，Satt290，Satt420，Satt452，Satt569和Sat_086，Sat107，Sat135)的重复序列区分别插入了1、6、6、3、4、3、8个3-碱基(ATT)重复和12、6、16个2-碱基(AT)重复，其等位基因长度分别增加了3、18、18、9、12、9、24个碱基对和24、12、32个碱基对。
2、在Sat_107，Satt185，Satt282，Satt420，Satt569，Satt579，Satt600等7个重复数变异座位的侧翼区还检测到11例单碱基突变，包括6例转换突变(其中4例为T→C)、2例颠换(A→T，T→A)、2例缺失(A，T)和1例插入(T)。
3、EMS诱变处理能够引起大豆基因组多个微卫星座位发生变异，包括重复序列区的重复数变异和侧翼区的单碱基突变，并发现了3种微卫星诱发突变的倾向：A、重复数的插入突变(占2/3)多于缺失突变；B、重复单位的插入/缺失部位大都(占14/15)位于重复序列区的始端，而且插入/缺失部位的左右两侧碱基多数(占12/15)为T和A；C、T→C的转换突变多于其它碱基突变类型。
4、大豆窄叶和4-粒荚两个重要突变性状均受隐性单基因控制，二者相互连锁(重组率为11.24％)。说明EMS能够诱发大豆基因组中相邻2个连锁基因同时产生突变。
5、利用突变体与其亲本的后代分离群体已经鉴定出与大豆窄叶突变基因相连锁的4个微卫星标记Satt117(4cM)、Satt185(13.6cM)、Satt452(2.5cM)、Satt483(17.8cM)和与4-粒荚突变基因连锁的4个微卫星标记Satt491(7.2cM)、Satt579(6.5cM)、Satt600(8.6cM)、Sat-107(3.2cM)。
6、选用4个近距离微卫星标记Satt117、Satt452、Sat-107和Satt579(2.5-6.5cM)对25个“窄叶”纯合品种和对25个“4-粒荚”比例高的纯合品种的基因组DNA进行扩增检验。结果发现，40％-52％的“窄叶”品种能扩出“窄叶”特异标记带，20％-28％的“4-粒荚”品种可检测到“4-粒荚”特异标记带。说明这些微卫星标记对某些大豆品种目标性状的辅助选择是有效的，而“窄叶”微卫星标记的应用范围更大一些。
Ⅱ硝态氮和铵态氮对大豆硝酸还原酶基因的表达调控研究
硝酸还原酶(NR)在植物对硝态氮(NO-3)的同化过程中起关键作用。NO-3的还原同化是大豆等作物利用无机氮的主要途径。本实验通过Northern杂交、酶活性与蛋白含量测定以及统计分析等方法，研究硝酸钾(硝态氮)、硫酸铵(铵态氮)和硝酸铵(混合态氮)对10个不同大豆品种的叶片硝酸还原酶基因的表达调控和叶片全氮量以及种子蛋白质含量的影响，分析其调控机制和变化规律。主要结果如下：
1、在三种形态氮的诱导处理下，所有供试品种的叶片NRmRNA转录量、NR活力、全氮含量以及籽粒蛋白质含量(硫酸铵-BY31处理组除外)等测定指标都高于各自的水处理对照组，说明施用三种氮肥均能提高大豆品种叶片的NR基因表达水平、NR活力、全氮量以及籽粒蛋白质含量，但不同处理的效果不一样，其顺序为NO3-＞NO3--NH4+＞NH4+，其中以硝态氮的诱导效果较为显著。
2、在不同氮肥尤其硝态氮肥的诱导下，多数高蛋白大豆品种的NRmRNA转录量、NR活力以及籽粒蛋白质含量的增加效果均高于低蛋白大豆品种。
3、所有供试大豆品种结荚期的叶片NR活力或全氮量与籽粒蛋白质含量之间的正相关都达到极显著水平，因此认为可以把结荚期叶片的NR活力或全氮含量作为选择高蛋白大豆材料的参考指标。
4、阐明了硝态氮和铵态氮调控大豆NR活性和NR基因表达的机制及规律性，从分子水平上揭示了施用硝态氮肥能增加大豆籽粒蛋白质含量的原因。