背景与目的目前,通过无创性方法产前检测单基因病仍是很困难的,这是由于母体血浆中的胎儿游离DNA只占母体血浆游离DNA的10%左右。理想的单基因病筛查技术应做到不需要父母致病位点和连锁SNPs位点,直接诊断胎儿基因型,一次性检测多个突变位点。我们研发了一种叫做游离DNA标记后单分子检测（cfDNA barcode-enabled single-molecule tes,cfBEST）的新技术可以满足上述要求。材料与方法1)cfBEST实验原理及概念验证实验:通过标记后cfDNA（Cell free DNA）片段建立预文库,预文库等分成两份,再用定位于目标位点附近的两对特异性引物和通用引物进行两步PCR扩增,产物混合后使用通用引物扩增。针对目标位点行高通量平行测序检测,分析突变分子频率,结合孟德尔定律和最大似然法,推断母胎地贫基因型组合。评估cfBEST技术的检测能力,我们用cfBEST检测已知低丰度突变频率的商业化标准品,并比较cfBEST和标准参考方法计算胎源性比例的一致性。2)用β-地贫携带者gDNA和cfDNA作为标准品,优化各项质控指标,包括:起始量DNA最小量,胎源性DNA 比例低限,“唯一性”reads数低限。3)对157例母胎基因型已经明确的母体血浆标本进行cfBEST检测,盲法验证以评估该技术的准确性。结果一、cfBEST概念验证实验1.cfBEST与ddPCR检测低丰度突变位点准确性比较对商业化低丰度突变频率标准品的检测结果显示,cfBEST和ddPCR在检测0%,0.05%,0.1%,and 0.5%突变频率的样本上具有可比性。2.SNPs计算胎源比例与Y染色体片段法比较以26例男性胎儿孕妇血浆样本为检测对象,分别用SNPs和Y染色体片段法计算的胎源比例,结果显示:两者一致性很高（R2=0.97）。二、cfBEST体系建立及优化使用gDNA和cfDNA标准品,分析cfBEST定量检测基因突变的各项质控指标:起始量DNA最小量10ng,胎源性DNA 比例低限5%,“唯一性”reads数低限1000。三、157例高风险家系样本盲法验证实验应用cfBEST检测157例母体血浆样本,并与有创性产前诊断结果进行比较。母体血浆中的胎源性游离DNA 比例:2.27%-22.85%,经过质控排除14例样本。使用一致性检验方法来分析cfBEST检测的准确性,kappa系数为0.98。cfBEST检测16种β-地贫突变位点的敏感度为99.19%（95%CI,97.62-100%）,特异度为99.92%（95%CI,99.82-100%）,阳性预测值为 97.62%（95%CI,94.96-100%）,阴性预测值为 99.97%（95%CI,99.92-100%）。结论1.以母体血浆中游离胎儿DNA为检测对象,cfBEST技术可同时检测多个基因突变位点。2.cfBEST技术检测点突变型和小片段插入和缺失型基因突变具有很高的特异性和敏感性,可以满足临床应用的要求。3.cfBEST技术不需要提前确定父母基因型和连锁SNPs位点,不仅适用于β-地贫高风险夫妇的无创性产前诊断,同样适用于对β-地贫和其他发病率较高的单基因病在特定人群的中的大规模无创性筛查。