论文部分内容阅读
目的评价淫羊藿女贞子煎剂及其提取物配伍防治糖皮质激素性骨质疏松症(glucocorticoid-induced osteoporosis,GIOP)的药效学作用,基于TGF-β1(transforming growth factor beta-1)/Smads信号通路探讨药对水煎剂及其提取物抗大鼠GIOP模型的作用机制。方法1.淫羊藿女贞子煎剂及提取物(总黄酮和萜类)对大鼠GIOP模型的药效学作用研究:SPF级健康雄性SD大鼠70只,随机分为7组,即正常对照组(正常组)、模型对照组(模型组)、淫羊藿女贞子煎剂高、低剂量组(煎剂高、低剂量组),淫羊藿女贞子提取物高、低剂量组(提取物高、低剂量组),钙尔奇组(阳性药对照组),每组10只。地塞米松1mg/kg肌肉注射建立大鼠骨质疏松模型,每周2次,共计8周。造模同时分别给予各组动物灌胃相应的药物或生理盐水,(1)煎剂高、低剂量组:分别给予淫羊藿女贞子(4:3)煎剂7g/kg、3.5g/kg体重灌胃;(2)提取物高、低剂量组:分别给予淫羊藿女贞子提取物200mg/kg、100mg/kg体重灌胃;(3)钙尔奇组:钙尔奇碳酸钙D3片0.2773g/kg体重灌胃;(4)正常组、模型组:分别给予等体积的生理盐水灌胃。8周后处死取材,采用双能X射线骨密度仪测量离体股骨骨密度(bone mineral density,BMD);三点弯曲法检测骨生物力学性能;比色法测定血清钙(calcium,Ca)、磷(phosphorus,P)的含量,电感耦合等离子体质谱法(Inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)测定骨Ca、P含量;酶免法检测血清骨碱性磷酸酶(bone alkaline phosphatase,b-ALP)、骨钙素(boneγ-carboxyglutamic acid-containing protein,BGP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,StrACP)含量;HE染色法检测骨组织病理学变化。2.淫羊藿女贞子煎剂及提取物(总黄酮和萜类)对大鼠GIOP模型的作用机制研究:动物造模和给药方法同实验一。酶免法检测血清皮质酮(corticosterone,CORT)、糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)的含量;流式细胞术检测骨组织GR蛋白含量及GR蛋白结合力;免疫荧光法(Immunofluorescence staining,IF)结合蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测骨组织TGF-β1、p-Smad2/3、Smad4、Smad7蛋白表达水平,实时荧光定量PCR技术(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测骨组织中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7 mRNA表达水平。结果1.淫羊藿女贞子煎剂及提取物(总黄酮和萜类)对大鼠GIOP模型的药效学作用研究结果:与正常组比较,GIOP模型组大鼠体重显著降低(P<0.01),股骨BMD以及股骨最大载荷和最大挠度均显著下降(P<0.01),血和骨Ca、P含量均显著降低(P<0.01),血清b-ALP、BGP含量显著下降(P<0.01),血StrACP含量显著升高(P<0.01),骨小梁面积百分比(trabecular bone area,Tb.Ar)、骨小梁数量(trabecular number,Tb.N)和骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)均显著减少(P<0.01),骨小梁分离度(trabecular separation,Tb.Sp)显著增加(P<0.01)。淫羊藿女贞子煎剂及提取物可显著增加大鼠体重(P<0.01)、BMD以及最大载荷和最大挠度(P<0.01),上调血和骨Ca、P含量(P<0.05或P<0.01),增加血清b-ALP、BGP含量(P<0.05或P<0.01),降低血清StrACP水平(P<0.01),改善骨病理形态,增加Tb.Ar、Tb.N和Tb.Th(P<0.01),减少Tb.Sp(P<0.01)。淫羊藿女贞子提取物高剂量组、煎剂高剂量组对上述指标的改善作用明显优于提取物低剂量组、煎剂低剂量组。2.淫羊藿女贞子煎剂及提取物(总黄酮和萜类)对大鼠GIOP模型的作用机制研究结果:模型组大鼠血清CORT和GR含量均较正常组显著降低(P<0.01),骨组织GR蛋白含量及GC-GR蛋白结合力显著上升(P<0.01)。IHC、WB和qRT-PCR的结果显示:模型组大鼠骨组织TGF-β1、p-Smad2/3和Smad4表达均较正常组显著下降(P<0.05或P<0.01),Smad7表达显著升高(P<0.01)。淫羊藿女贞子煎剂及提取物可增加血清CORT和GR含量(P<0.05或P<0.01),降低骨组织GR蛋白含量及GC-GR蛋白结合力(P<0.05或P<0.01),上调骨组织TGF-β1、p-Smad2/3和Smad4表达水平(P<0.05或P<0.01),下调Smad7表达水平(P<0.01)。结论1.淫羊藿女贞子煎剂及提取物可通过有效逆转GC诱导的低转换型骨代谢状态,调节骨形成与骨吸收间的偶联平衡,增加BMD,增强骨生物力学性能,逆转骨组织病理样改变等途径而发挥抗GIOP作用。2.淫羊藿女贞子煎剂及提取物可减少GR在骨组织中的表达量,从而抑制骨组织中GC与GR的结合,降低GC对骨的危害。同时,还能明显改善GC对血清中CORT、GR的抑制作用,提高激素作用的敏感性,从而对内源性GC作用途径有良好的保护作用,减少激素用量,降低GIOP的发生。3.淫羊藿女贞子煎剂及提取物配伍对GIOP的作用机制可能与调节TGF-β1/Smads通路信号转导因子的表达水平有关。4.综合考虑各项指标的作用效果,淫羊藿女贞子煎剂及提取物组防治GIOP的效果显著优于钙尔奇组,以提取物高、煎剂高剂量组的改善作用较优;淫羊藿女贞子提取物配伍同水煎剂一样对GC致OP模型有良好的防治作用。