癫痫是人类历史上最为古老的疾病之一,至今仍然是神经系统疾病中仅次于脑血管病的第二大常见病。癫痫也是生育期妇女的常见疾病,孕期癫痫给孕母和胎儿的健康均带来极大的威胁。临床研究表明,孕期癫痫发作与子代的神经发育迟滞甚至远期认知障碍密切相关,但目前机制尚不明确,而且研究常常受孕期抗癫痫药、基因遗传、家庭及社会环境等多种不可控因素所干扰,很难获得公认的可靠结论。相比而言,动物实验在这一领域的研究有着不可替代的优势,能够排除上述混杂因素,加入可控性干预,对于孕期发作对子代损伤的机制研究及治疗探索有着极为重要的价值。未成熟脑对各种损伤极为敏感。研究发现,孕期癫痫发作能够增加胎儿宫内缺氧缺血及酸中毒的风险,从而造成胎儿不可逆损伤。在成人和胎儿疾病中,缺氧常常进一步引发氧化应激而加重组织损伤。现已证实,氧化应激在脑血管病、肌萎缩侧索硬化症、帕金森病及癫痫等多种神经系统疾病的发生发展中起着至关重要的作用。同时,宫内缺氧缺血、产前子痫、宫内炎症等胎儿期的一些常见致病因素,也被证实与氧化应激密切相关。因此可以推测,氧化应激可能是孕期癫痫所致胎儿宫内损伤的重要机制,而这一机制似乎可以为孕期癫痫的胎儿保护提供新的治疗靶点,但此类研究目前国内外尚未有人报道。虾青素(Astaxanthin,ATX)是一种天然的类胡萝卜素,在自然界尤其是海洋生物体内广泛存在。同时,虾青素具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等多种生物学活性,尤其是超强的抗氧化性最为突出。近年来研究发现,虾青素容易透过血脑屏障,其在中枢神经系统疾病中的积极作用也得到了越来越多的关注。但虾青素在癫痫及母孕期癫痫的研究却未见报道。本实验采用杏仁核慢性电点燃癫痫孕鼠模型,观察母孕期癫痫发作对子代海马结构的损伤、认知功能的影响及可能的机制,证实氧化应激与其发病密切相关。同时,从抗氧化机制为切入点,选择虾青素为干预药物,在初步明确虾青素对癫痫大鼠的神经保护作用和安全性之后,进一步评价虾青素对致痫孕鼠子代的海马保护和认知改善作用,为癫痫孕母子代的神经保护探索新的治疗途径。第一部分杏仁核电点燃癫痫孕鼠子代认知功能损伤的研究目的:观察孕鼠电点燃癫痫发作对子代海马神经元的损伤情况以及对成年子代认知功能的影响;同时通过胎盘组织病理学和氧化应激参数的检测来证实氧化应激可能与其发病密切相关。方法:成年雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为三组:正常对照组、电点燃组和假手术组。电点燃组行杏仁核慢性电点燃模型制备,假手术组组仅给予电极植入,不给予电刺激。首先制备杏仁核慢性电点燃癫痫模型每天电刺激1次,完全点燃1周后,各组雌鼠与健康雄鼠合笼使其受孕,孕期继续给予每两日一次电刺激,参数不变直至孕20天。后孕鼠自然分娩。比较各组分娩仔鼠数目、仔鼠存活率及出生体重有无差异。通过孕鼠胎盘组织HE染色观察胎盘缺血缺氧性病理改变;通过新生子代海马组织中丙二醛(malondialdehyde,MDA)和谷胱甘肽(Glutathione,GSH)的检测观察胎儿宫内氧化损伤情况;通过新生子代和生后12周子代海马组织尼氏染色观察子代近远期神经损伤情况;通过生后12周子代Morris水迷宫检测子代远期学习记忆能力。结果:1、成功创建杏仁核电点燃癫痫孕鼠模型,怀孕对癫痫发作无明显影响。2、大鼠孕期和分娩情况:电点燃组新生大鼠存活率与对照组及假手术组相比显著降低(P<0.01),而每只产仔数量、仔鼠出生体重则无明显差异。3、孕鼠胎盘组织HE染色:正常对照组和假手术组胎盘结构正常。电点燃组绒毛滋养细胞大量增殖,排列紊乱,绒毛血管基底膜增厚,管腔变窄;同时迷路带内间质细胞增生,可见核固缩,核碎裂,大量淋巴细胞浸润。4、子代海马组织尼氏染色:孕期癫痫发作对近远期子代海马结构均造成明显损伤,新生子代神经元丢失更为明显。5、氧化应激参数的改变:与对照组相比,电点燃组大鼠海马组织中MDA水平明显升高(P<0.01),而GSH含量明显降低(P<0.01)。假手术组与对照组相比,此两项指标差别均无明显统计学意义(P>0.05)。6、成年子代(生后12周)Morris水迷宫检测结果:(1)定位航行实验结果:对照组、电点燃组及假手术组子代的逃避潜伏期在第1和2天无显著差别(P>0.05)。实验第3、4、5天,各组逃避潜伏期均比第1、2天有缩短趋势;而且电点燃组与对照组相比逃避潜伏期均明显延长(P<0.01),假手术组与对照组逃避潜伏期没有明显差异(P>0.05)。(2)空间探索试验结果:与对照组相比,电点燃组120s内穿越平台区域的次数明显低于对照组(P<0.01),平台象限游泳时间也明显减少(P<0.01)。对照组与假手术组相比此两项指标均无显著性差异(P>0.05)。结论:本实验表明,孕期癫痫发作可导致子代近期和远期的海马结构损伤,进一步导致成年期子代认知损伤,胎盘缺血缺氧和胎儿宫内氧化应激是导致子代损伤的重要机制。第二部分虾青素对癫痫大鼠神经保护作用的初步研究目的:评估虾青素对慢性电点燃癫痫大鼠的神经保护作用及安全性,并通过海马氧化应激指标的检测初步探讨其作用机制,为其进一步应用于癫痫孕鼠提供必要的实验证据。方法:成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为四组:对照组、虾青素组、电点燃组及电点燃+虾青素组。后两组制备杏仁核慢性电点燃模型,每天电刺激1次,连续15天。虾青素(30mg/kg/day)每日于电刺激前1小时给予腹腔注射。通过比较大鼠点燃过程中发作等级和后放电持续时间(afterdischarge duration,ADD),观察虾青素对点燃进程的影响;通过尼氏染色观察虾青素对神经元的保护作用;通过海马组织中氧化应激参数(丙二醛和谷胱甘肽)的检测观察虾青素对癫痫发作所致氧化损伤的改善情况。结果:1、虾青素对慢性癫痫模型点燃进程的影响:所有致痫大鼠随电刺激增多发作等级逐渐增高。在第12-15天时,电点燃+虾青素组较电点燃组发作等级明显降低(均为P<0.05);同时在第8-15天时,电点燃+虾青素组较电点燃组ADD显著缩短(均为P<0.05)。对照组和ATX组均未出现癫痫发作。2、尼氏染色结果:对照组海马神经元形态正常,排列紧密。电点燃组大鼠海马神经元损伤显著,丢失明显;给予虾青素干预后结构明显改善。单独虾青素组与对照组相比没有明显差别。3、氧化应激参数的改变:与对照组相比,电点燃组大鼠海马组织中MDA水平明显升高(P<0.01),而GSH含量明显降低(P<0.01)。虾青素治疗后MDA水平显著下降(P<0.01),GSH水平显著升高(P<0.05),但与对照组相比MDA和GSH仍有明显差异(均为P<0.05)。虾青素单独用药组与对照组相比MDA和GSH均无明显差异(P>0.05)。结论:本实验数据显示,虾青素对致痫大鼠海马有明显神经保护作用,其机制与抗氧化应激以及潜在的抗癫痫作用有关。同时本实验肯定了虾青素较高的安全性,为其进一步在癫痫孕鼠的应用提供了依据。第三部分虾青素对癫痫孕鼠新生子代的神经保护作用目的:选择虾青素作为孕期干预药物,观察其对癫痫孕鼠新生子代的海马保护作用,并通过胎盘病理、子代海马氧化应激指标及海马CREB和BDNF蛋白和基因表达水平来探讨其可能的机制。方法:成年雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为四组:对照组、虾青素组、电点燃组及电点燃+虾青素组。后两组行杏仁核慢性电点燃模型制备,每天电刺激1次,完全点燃1周后,各组雌鼠与健康雄鼠合笼使其受孕,孕期继续给予每两日一次电刺激,参数不变直至孕20天。ATX(30mg/kg/d)于孕期G1至G20天给予每天一次腹腔注射。待孕鼠自然分娩。观察大鼠孕期一般情况,虾青素对分娩仔鼠数目、仔鼠存活率及出生体重的影响。通过海马组织尼氏染色观察虾青素对癫痫孕鼠新生子代神经损伤改善情况;通过孕鼠胎盘组织HE染色观察虾青素对癫痫孕鼠胎盘缺血缺氧性病变的影响;通过新生子代海马组织中MDA和GSH的检测观察虾青素对癫痫孕鼠胎儿宫内氧化损伤的改善作用;通过新生子代海马组织Western-blot和Real-time PCR检测观察虾青素对CREB-BDNF信号通路的影响。结果:1、大鼠孕期和分娩情况:孕期各组孕鼠一般情况良好。孕期干预虾青素使癫痫孕鼠新生子代存活率明显上升(P<0.05),对产仔数量、胎儿出生体重无明显影响(P>0.05)。单独虾青素组与对照组相比,孕期及分娩情况各项均无明显差别(P>0.05)。2、孕鼠胎盘组织HE染色:电点燃组孕鼠胎盘绒毛和迷路带损伤严重,而虾青素干预后损伤明显减轻;单独虾青素组和对照组胎盘结构均正常。3、新生子代海马组织尼氏染色:电点燃组海马CA1和CA3区损伤显著,神经元丢失明显;虾青素干预后损伤明显改善,单独虾青素组和对照组孕鼠新生子代海马结构均正常。4、新生子代海马组织氧化应激参数的改变:与电点燃组相比,虾青素干预后癫痫孕鼠子代MDA水平明显下降(P<0.01),而GSH水平明显升高（P<0.05);单独虾青素组与对照组相比,此两项指标均无明显差别(P>0.05)。5、新生子代海马组织中Western blot检测结果:电点燃组与对照组相比,CREB和BDNF蛋白表达均显著下降(均为P<0.01),而虾青素干预后二者均显著升高(均为P<0.01),单独虾青素组与对照组之间则无明显差异(均为P>0.05)。6、新生子代海马组织中Real-time PCR检测结果:电点燃组与对照组相比,CREB和BDNF基因表达均显著下降(均为P<0.05),而虾青素干预后二者均显著升高(CREB为P<0.01,BDNF为P<0.05),单独虾青素组与对照组之间则无明显差异(P>0.05)。结论:本实验结果表明,孕期干预虾青素,能够减轻孕期癫痫所致新生子代的海马神经元损伤,可能通过减轻胎盘缺血缺氧、减轻胎儿宫内氧化应激及活化CREB-BDNF信号通路等机制来实现。第四部分虾青素对癫痫孕鼠成年子代认知功能的保护作用目的:选择虾青素作为孕期干预药物,通过观察子代生后12周时的学习记忆能力、海马神经元和突触结构及认知相关通路蛋白水平变化来评价虾青素对癫痫孕鼠成年期子代的认知保护作用。方法:成年雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为四组:对照组、虾青素组、电点燃组及电点燃+虾青素组。后两组行杏仁核慢性电点燃癫痫模型制备,每天电刺激1次,完全点燃1周后,各组雌鼠合笼使其受孕,孕期继续给予每两日一次电刺激,参数不变直至孕20天。ATX(30mg/kg/d)于孕期G1至G20天给予每天一次腹腔注射。待孕鼠自然分娩后,子代继续饲养至12周。通过Morris水迷宫检测虾青素对癫痫孕鼠成年子代学习记忆能力的影响;通过海马组织尼氏染色和透射电镜观察虾青素对癫痫孕鼠成年子代神经损伤的改善情况;通过Western-blot和Real-time PCR检测虾青素对癫痫孕鼠成年子代海马中CREB和BDNF表达的影响。结果:1、成年子代Morris水迷宫检测结果:(1)定位航行实验结果:在实验第1、2天,各组每日逃避潜伏期无显著差别(P>0.05)。实验第3、4、5天,各组逃避潜伏期均比第1、2天有缩短趋势,虾青素+电点燃组与电点燃组相比,逃避潜伏期均明显缩短(第3天P<0.05,第4和5天均为P<0.01);单独虾青素组与对照组的逃避潜伏期均无明显差别(均为P>0.05)。(2)空间探索试验结果:在子代120 s内穿越平台次数和平台象限游泳时间方面,电点燃+虾青素组较电点燃组均显著改善(均为P<0.01);而单独虾青素组和对照组相比上述两项测试均无明显差异(均为P>0.05)。2、成年子代海马组织尼氏染色结果:电点燃组癫痫孕鼠子代海马组织CA1和CA3区损伤明显,虾青素干预后损伤明显改善,单独虾青素组和对照组孕鼠新生子代海马组织结构均正常。3、成年子代海马超微结构变化:在透射电镜下观察海马CA1区发现,对照组神经元和突触结构正常。电点燃组神经元胞质内细胞器稍减少,线粒体嵴肿胀,内质网扩张,核周隙扩张,线粒体偶呈空泡化;神经毡内突触减少,突触前后膜结构不清楚,无突触间隙,囊泡不清楚,前膜部分缺失。虾青素+电点燃组神经元和突触结构明显趋于正常。虾青素组和正常对照组比较超微结构无明显差别。4、Western blot检测结果:电点燃组与对照组相比,成年子代海马组织中CREB和BDNF蛋白表达均显著下降(均为P<0.01),而虾青素干预后二者均显著升高(均为P<0.01),单独虾青素组与对照组之间则无明显差异(均为P>0.05)。5、Real-time PCR检测结果:电点燃组与对照组相比,成年子代海马组织中CREB和BDNF基因表达均显著下降(均为P<0.01),而虾青素干预后二者均显著升高(均为P<0.01),单独虾青素组与对照组之间则无明显差异(均为P>0.05)。结论:本实验结果表明,孕期干预虾青素,能够改善母孕期癫痫发作所致的成年子代的认知功能损伤,其机制可能与减轻海马结构损伤以及活化认知相关的CREB-BDNF信号通路密切相关。本实验证实了虾青素的孕期干预对癫痫孕鼠子代的近远期神经保护作用,为孕期癫痫的胎儿神经保护探索了新的治疗途径。