宫颈癌是女性常见的恶性肿瘤之一。尽管宫颈癌筛查在不断普及,但仍有大量浸润性宫颈癌被诊断。手术和放疗是宫颈癌的根治性治疗手段,但手术仅适用于早期病例。放疗虽然适合于各期病例,但可对卵巢和阴道造成不可逆的损伤,严重影响年轻患者的生活质量。宫颈癌对化疗仅中等敏感,故目前化疗主要应用于宫颈癌局部晚期病例的辅助性治疗和晚期病例的姑息性治疗。鉴于上述各种原因,浸润性宫颈癌的预后并不乐观。因此,寻找常规手术、放疗和化疗以外的新的治疗方法,对改善宫颈癌预后有重要的现实意义。业已公认,高危人乳头瘤病毒(HR-HPV)的持续感染是宫颈癌发病关键的和必要的致病因素。在所有HPV感染中,16型占了50%以上。HR-HPV E6/E7癌基因的过度表达不仅是导致宫颈癌发病的关键基因,也是维持宫颈癌恶性表型的关键基因。宫颈癌明确的致病因素和致病机理为HR-HPV感染和宫颈癌的阻断治疗提供了明确的靶标。RNAi能高效、特异地抑制某个基因的表达,故在病毒相关性疾病、遗传性疾病及恶性肿瘤的功能基因组的研究中具有广阔的应用前景。由于宫颈癌细胞中整合的HPV癌基因属于外源性,与人体自身基因无同源性,及明确的靶标为基因阻断(RNAi)治疗提供了一个理想模型。siRNA介导的基因沉默可分为转录水平和转录后水平。鉴于HPV16早期癌蛋白E6和E7受共同启动子p97调控,因此我们采用了有别于传统siRNA与编码区序列同源的转录后水平的基因沉默方法。转录水平基因沉默的作用机制是：与启动子区CpG岛同源的siRNA可通过诱导RNA引导的DNA甲基化(RdDM)、组蛋白的修饰和异染色质的形成等表观遗传改变导致靶基因的转录受到抑制。此方法的优势是：沉默过程不涉及DNA序列改变的表观遗传学改变,并可通过印记遗传给子代,使基因沉默具有遗传效应。合适的载体是siRNA介导基因沉默的重要环节。其中慢病毒载体以其在临床前治疗及临床试验中已表现明显的优势。慢病毒与其他病毒载体相比,具有操作简洁,感染效能高,可感染细胞广,转移基因片段容量大,作用稳定(这更适合在肿瘤中应用),安全性好等优点,已成为当前基因治疗和转基因动物中载体研究的良好运载工具。在本研究中,我们首先构建慢病毒载体搭载HPV16E6/E7启动子shRNA和E6编码区shRNA,其次转导宫颈癌HPV16阳性细胞株Siha和Caski,筛选并建立稳转单克隆细胞株,检测单克隆细胞株中HPV16E6/E7在mRNA及蛋白水平的表达变化,同时检测了E6相关蛋白MCM7和p53,E7相关蛋白pRB和p16的表达变化。随后观察LV-shRNA导入前后细胞增殖能力和侵袭能力的变化。最后,分别将Siha和Caski稳转单克隆细胞株及其阴性对照组细胞接种于裸鼠皮下,详细记录体内成瘤及生长情况及裸鼠体重变化。至观察阶段性中点,部分裸鼠安乐死后剥离瘤体称重,剩余裸鼠继续观察生存期。旨在证明转录水平siRNA基因沉默的有效性及探讨癌基因E6/E7在体内外导致宫颈恶性转化和维持恶性表型中的作用,为探索宫颈癌治疗新策略和新靶点提供实验依据。第一部分靶向HPV16E6/E7共同启动子shRNA慢病毒的构建及鉴定目的：以HPV16E6/E7共同启动子为靶标设计shRNA序列,构建慢病毒载体,为后续证明转录水平siRNA稳定基因沉默有效性的研究提供工具。方法：根据BLOCK-iTTM Lentiviral RNAi Expression System要求设计特异性靶向HPV16E6/E7共同启动子的shRNA序列,经由上海生工合成后,将shRNA序列导入pENTRTM/U6入门载体,小抽质粒测序。再将测序正确的pENTRTM/U6入门载体导入pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST生成表达载体,中抽质粒,双酶切,电泳鉴定。随后将鉴定正确的表达载体与ViraPowerTM包装混合物共转染293FT细胞,包装出病毒。最后进行病毒浓缩及经典的HT1080细胞进行滴度测定。结果：1. pENTRTM/U6入门载体小提质粒后测序提示插入序列正确。2.入门载体导入pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST表达载体,双酶切,电泳鉴定正确。3.包装所得病毒液滴度测定结果为2.2*106TU/ml。4. Siha、Caski和HT1080三种细胞的Blasticidin最小致死浓度结果分别为4ug/ml,6ug/ml和4ug/ml。结论：1.成功构建了搭载HPV16E6/E7共同启动子shRNA重组慢病毒载体。2.成功包装了高滴度的重组慢病毒。第二部分慢病毒介导的E6/E7共同启动子shRNA对宫颈癌细胞株生长抑制作用的体外研究目的：证明我们构建的搭载HPV16E6/E7共同启动子shRNA重组慢病毒载体在转录水平稳定沉默E6/E7癌基因的有效性,并探讨癌基因E6/E7在体外维持恶性表型中的作用。方法：首先将慢病毒对Siha/Caski细胞进行转导,采用Western-blot法检测细胞内核纤维蛋白laminA/C的变化,得出每个细胞株最佳MOI值。根据最佳MOI值转导Siha/Caski细胞,并用相应的Blasticidin浓度筛选,得到稳转细胞株。采用无限稀释法,得到稳转单克隆细胞,并使用Realtime-PCR法检测E6,E7mRNA的表达水平,筛选最佳稳转单克隆细胞株。随后用Western-blot法,MTT法及Transwell小室检测两稳转单克隆细胞株的E6、MCM7、p53、E7、pRB、p16蛋白的改变,增殖及侵袭能力的变化,以验证转录水平的干扰效果。结果：1. Siha细胞最佳MOI值为2；Caski最佳MOI值为5。2.成功筛选出Siha/Caski稳转单克隆细胞株。3.慢病毒介导的E6/E7共同启动子shRNA有效抑制了Siha/Caski稳转单克隆细胞株E6/E7mRNA的表达。4.慢病毒介导的E6/E7共同启动子shRNA有效抑制了E6、MCM7、E7、p16蛋白的表达,上调了p53和pRB蛋白的表达。5.慢病毒介导的E6/E7共同启动子shRNA有效抑制了稳转单克隆细胞株的增殖能力和侵袭能力。结论：1.慢病毒是携带干扰RNA进入宫颈癌细胞的理想载体。2. LV-shRNA能有效将治疗基因导入宫颈癌细胞,建立稳转单克隆细胞株。3.慢病毒介导的E6/E7共同启动子shRNA能特异性抑制宫颈癌单克隆细胞E6/E7mRNA和蛋白水平的表达,并有效抑制宫颈癌单克隆细胞株的增殖与侵袭力。第三部分慢病毒介导的E6/E7共同启动子shRNA对宫颈癌移植瘤生长抑制作用的体内研究目的：证明我们构建的搭载HPV16E6/E7共同启动子shRNA重组慢病毒载体能有效抑制动物体内宫颈癌移植瘤的生长,为宫颈癌治疗提供新的治疗手段。方法：将慢病毒介导的E6/E7共同启动子shRNA稳转宫颈癌Siha/Caski单克隆细胞株接种于裸鼠皮下,观察其在裸鼠荷瘤模型中成瘤能力,观察并详细记录裸鼠生长情况、每只裸鼠体重以及裸鼠生存期数据。结果：1.成功建立荷瘤裸鼠模型,成瘤率100%。2.荷瘤裸鼠各实验组与相应对照组之间裸鼠体重变化较为一致,无明显差异。3.荷瘤裸鼠LV-shRNA实验组瘤体生长速度明显缓于对应的对照组,并且裸鼠解剖后离体瘤的重量也明显小于相应的对照组。4.荷瘤裸鼠LV-shRNA实验组生存时间明显长于相应的对照组。结论：1.慢病毒介导的E6/E7共同启动子shRNA能有效抑制宫颈癌荷瘤鼠体内移植瘤的生长。2.慢病毒介导的E6/E7共同启动子shRNA能明显延长荷瘤裸鼠的生存期。