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目的:急性肺损伤(acute lung injury, ALI)是各种致病因素(如创伤、感染、缺血再灌注、烧伤等)导致的急性进行性呼吸衰竭,严重的ALI被定义为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS),其发病机制至今尚不完全清楚。脂多糖(lipopolysaca charide,LPS)是革兰氏阴性杆菌细胞壁上的成分,它能够诱发重症肺炎,从而引起ARDS。ALI起病急,进展快,至今尚无特异性治疗。近几年尽管采用了新的通气技术和其它治疗措施如糖皮质激素等,ARDS的死亡率仍高达40%-60%。如何防止ALI的发展引起人们的高度重视。有研究表明ALI的后果依赖于致炎因子和抗炎因子的平衡。炎症因子种类很多,但产生炎症因子的信号途径较少。因此我们从信号转导途径方面研究ALI的发病机制,为临床防治ALI提供理论依据。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPKs)是多种信号途径的交汇点。在微生物感染所致的免疫反应中,巨噬细胞中的MAPKs发挥关键的调节作用。信号转导及转录活化因子(signal transducers and activators of transcription, STAT)是一类脱氧核糖核酸结合蛋白,是细胞因子产生的关键调节者。关于LPS与细胞因子生成的研究结果显示,干预LPS的细胞内信号转导是人为控制炎症级联反应的重要途径,大量研究显示MAPKs在LPS信号的细胞内传递中具有重要作用,是人为控制LPS炎症反应的潜在靶位。LPS主要和肺泡巨噬细胞发生作用,巨噬细胞组成肺组织第一道防线。本实验以LPS刺激小鼠肺泡巨噬细胞株(MH-S cells)为研究对象,观察细胞内p-STAT3表达水平及细胞上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)的变化,及用p38的特异性抑制剂SB203580干预后p-STAT3表达的变化。从信号转导途径探讨LPS致ALI的机制,为临床防治ALI提供理论依据。方法:1酶联免疫吸附试剂盒(ELISA试剂盒)检测细胞上清液中TNF-α的浓度。首先常规培养传代MH-S细胞株,细胞传代时进行细胞计数,调节细胞浓度为5×106/ml,于24孔板中培养过夜,随机分为5组。①对照组:加入与实验组等体积的无血清1640培养液;②LPS组:LPS终浓度100ng/ml,分别刺激90min、2h、4h、6h、12h后取细胞上清液;③SB5 +LPS组:培养液中加入终浓度为5μΜ的SB203580,20min后加入LPS,LPS终浓度100ng/ml,用LPS刺激90min、2h、4h、6h、12h后取细胞上清液;④SB10 +LPS组:培养液中加入终浓度为10μΜ的SB203580,20min后加入LPS,LPS终浓度100ng/ml,用LPS刺激90min、2h、4h、6h、12h后取细胞上清液;⑤SB15+LPS组:培养液中加入终浓度为15μΜ的SB203580,20min后加入LPS,LPS终浓度100ng/ml,用LPS刺激90min、2h、4h、6h、12h后取细胞上清液。-80℃保存细胞上清液,ELISA试剂盒检测各组细胞上清液中TNF-α的含量。2 Western blot方法检测SB203580对LPS诱导MH-S细胞STAT3磷酸化的影响。实验共分5组:①对照组:加入与实验组等体积的无血清1640培养液;②LPS15min组:LPS终浓度100ng/ml,刺激15分钟;③LPS30min组:LPS终浓度100ng/ml,刺激30分钟;④SB10+LPS15min组:SB203580终浓度10μM,LPS终浓度100ng/ml,刺激15分钟,在LPS刺激前20分钟用SB进行干预;⑤SB10+LPS30min组:SB203580终浓度10μM,LPS终浓度100ng/ml,刺激30分钟,在LPS刺激前20分钟用SB进行干预。各实验组细胞刺激成功后收集细胞,离心(1500rpm,4℃,10min) ,弃去上清, -80℃保存细胞用于提取总蛋白,Western-blot技术,检测细胞内p-STAT3表达。3免疫细胞化学方法检测LPS诱导的MH-S细胞内磷酸化STAT3的表达。于6孔板中上述各组细胞爬片,实验分组同Western blot,爬满后做免疫细胞化学。数据以均数±标准差( )表示。各组比较用单因素方差分析(One way ANOVA) ,如有显著性进一步用Student-Newman-Keuls(SNK-q)检验,P<0.05表示有统计学意义。结果:(1) ELISA法显示细胞上清液中TNF-α含量变化。LPS刺激MH-S细胞后,细胞上清液中TNF-α含量增加,LPS刺激90min,TNF-α含量开始升高,4h和6h达最高值,12h含量降低。经单因素方差分析,对照组、LPS组与SB+LPS组,三组间TNF-α表达水平差异显著(P<0.05),SB203580(10μΜ和15μΜ)预处理,显著抑制LPS诱导的TNF-α含量增加,与LPS组比较,差异有统计学意义(P<0.05),且与SB的剂量呈正相关。SB203580(5μΜ)组,TNF-α含量虽有下降趋势,但与LPS组比较差异无统计学意义(P>0.05)。(2) Western blot结果显示LPS15min和LPS30min组磷酸化STAT3蛋白表达水平高于对照组和SB抑制组,LPS30min组表达水平高于LPS15min组。(3)免疫细胞化学结果表明:对照组细胞几乎无黄染, LPS15min组细胞开始出现黄染,LPS30min组细胞黄染增强,用SB203580干预后细胞黄染变淡。经单因素方差分析,各组与对照组比较,p-STAT3表达水平差异有统计学意义(P<0.05);LP15min与SB10+LPS15min组比较差异有统计学意义(P<0.05) ;LPS30min与SB10+LPS30min组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:1 LPS刺激MH-S细胞引起细胞上清中TNF-α分泌增加;用p38MAPK的抑制剂SB203580干预后,TNF-α的分泌呈剂量依赖性减少。2 LPS15min组和LPS30min组,MH-S细胞p-STAT3表达水平强于对照组和SB203580抑制组,LPS30min组表达水平强于LPS15min组。SB203580使p-STAT3表达减少,可能是通过抑制p38MAPK进而抑制p-STAT3表达。