荧光标记方法是最有效、快捷的生物标记方法之一,起源于20世纪40年代,最早被用于荧光标记抗体来检测相应的抗原。随着生命科学的进步与发展和各种先进荧光检测仪器及技术的应用,非放射性的荧光标记作因其操作简便、稳定性高、灵敏度高和选择性高等特点而受到广泛的关注,并取得迅速发展。随着生物显微成像技术的发展,双光子荧光显微镜已经成为新一代细胞或组织显微成像的工具。双光子显微镜的发展已经彻底改变了在活性细胞和组织(特别是厚的或高散射的标本)观测中的问题。与单光子激光共聚焦显微镜相比,双光子显微镜具有诸如近红外光激发、避免荧光漂白和光致毒、高分辨率、减小组织对激发光的吸收及降低组织自发荧光干扰等特点。但是,如果所用荧光染料的双光子吸收截面小(与生物样品的内源性发光物质相近),那么双光子显微镜优势会被大打折扣。由于理论上单、双光子吸收服从不同的选律,所以优秀的单光子荧光生物染料不一定具备大的双光子活性荧光截面。目前用于激光共聚焦显微镜的单光子荧光生物染料几乎都不具备大的双光子荧光活性吸收截面,这限制了双光子荧光显微镜的应用推广。因而,开发优良的双子荧光生物染料的研究成为一个热门课题。本论文以分析化学、有机化学、生物科学与染料化学的交叉为立足点,从分子结构的创新入手,设计合成一系列含有苯并噻唑或苯并咪唑的新型染料分子,为荧光生物染料在双光子荧光成像中出现的瓶颈问题提供解决方案。围绕着这个目的,本论文主要开展了以下工作:(1)设计、合成了一系列新颖的膜通透性双光子荧光染料BTVPA、BIVPA、BTPA、BIPA、BTVCZ、BIVCZ和BTCZ,并进行了详尽的光物理性质的测试、细胞成像实验和初步应用的探讨。与经典的香豆素、荧光素和罗丹明类染料相比,BTVPA、BIVPA、BTPA、BIPA、BTVCZ、BIVCZ 和 BTCZ 具有显著的优点:其双光子吸收截面远远大于以上三大经典染料,而且保留了这些经典染料的膜通透性。BTVPA染料具有多个改造位点,可以通过连接靶向基团进行双光子探针的改造。本研究中,我们在BTVPA染料平台基础上构建了双光子核酸探针BTVPA-nucleic acid,双光子荧光成像表明:探针BTVPA-nucleic acid能够高质量的标记细胞内的细胞核。(2)设计、合成了六个 RNA 探针 DHTI、DMTI、DMI、IMT-E、IMT-M 和IMI。体外荧光滴定实验证明六个探针对RNA具有较高的选择性和灵敏的光开关性能;单光子、双光子生物荧光成像表明六个探针均能获得细胞内核仁和细胞质中RNA清晰的荧光成像图片,具有优秀的膜通透性和内源性RNA的选择性。RNA消化实验进一步证明了这六个探针可以优先选着细胞内源性的RNA,当RNA被水解之后,才能与细胞内源性的DNA相结合;核仁的形态、大小和数量与细胞的恶变息息相关,通过利用红发射的双光子RNA探针DHTI或DMTI与Hoechst 33342在活性或固定HeLa细胞的宽场、激光共聚焦和双光子共染荧光成像图片。我们不仅能够清晰的能观察出核仁的大小、数量和形态,还可以观察细胞核和胞质的轮廓,这些形态信息可能为科研工作者对癌症的诊断提供参考依据。(3)由于线粒体的动态变化多数都是由DNA参与而引起的,所以线粒体DNA探针将对给科研研究提供重要的支持,本论文设计合成了两个红光发射的双光子线粒体DNA探针DMT-M和DMT-E。体外荧光滴定实验证明了对DNA具有灵敏的光开关性能;用单光子共聚焦和双光子显微镜获得了清晰的荧光成像花丝状线粒体的图片,表明这两个探针高的线粒体选择性和优秀的膜通透性;DNA消化实验进一步证明了探针DMT-M和DMT-E线粒体DNA的选择性,当DNA被水解之后,荧光强度明显降低;通过与SYTOS-11348与DMT-M或DMT-E的共染实验,进一步证明了这两个探针优秀的细胞膜通透性和可以进行健康的活细胞染色;光稳定实验证明了探针具有可持续追踪观察线粒体形态变化的潜质。(4)针对内质网具备磷脂分子层膜结构的特点,在膜探针的基础上,设计合成双光子红光发射的内质网探针MDT。用单光子共聚焦和双光子显微镜,获得了清晰的荧光成像网状内质网的图片,说明了此探针高的线粒体选择性和优秀的膜通透性;MTT实验证明了探针的低毒性和生物相容性;由于固定细胞的线粒体不具备膜电位,用固定细胞的单、双光子成像实验排除阳离子型探针MDT对细胞内线粒体的干扰。此研究能够为以膜靶向的内质网探针提供设计思路。总之,在本论文中设计合成了一系列膜通透性的双光子染料平台、RNA探针、线粒体DNA探针,详细的研究了这些荧光染料的双光子性能。这些染料平台的双光子吸收截面远远大于经典罗丹明、香豆素和荧光素染料,并且保留了经典生物染料的膜通透性。本文也重点对这六种RNA探针与RNA的识别机理进行了详细的探讨,并首次提出了利用红光发射的双光子RNA探针DHTI与DMTI与Hoechst 33342在活性或固定HeLa细胞的宽场、激光共聚焦和双光子显微镜下的共染荧光成像图片来观测核仁的大小、数量、形态和细胞核或胞质的轮廓,这可能对恶性肿瘤细胞的检测提供参考依据。另外,利用调解阳离子盐与DNA的结合能力,设计合成了线粒体DNA探针DMT-M和DMT-E,可以长时间的对线粒体的形态变化进行了追踪。本论文对双光子生物荧光染料的设计、合成提供了重要依据,将对双光子显微镜在生物成像领域的应用起到推广作用。