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背景与目的:慢性阻塞性肺疾病（Chonic Obstructive Pulmonary Disease,COPD）是一种严重危害人类健康的常见病、多发病。呼吸衰竭是COPD主要的并发症,也是其主要的死亡原因。COPD急性加重期患者由于感染、缺氧、营养不良等因素易导致骨骼肌及呼吸肌功能障碍,出现呼吸肌疲劳,甚至呼吸衰竭,严重影响了患者的呼吸状况及生活质量,甚至危及生命。膈肌是最主要的呼吸肌,它收缩所产生的通气量约占肺静息通气量的80%。在COPD患者中,膈肌经历纤维类型转化,出现膈肌萎缩,损伤和细胞凋亡。而膈肌细胞萎缩,损伤,多与氧化应激与细胞凋亡有关。COPD恶化过程中的细胞凋亡可能是由过量的活性氧物质刺激所致。COPD患者由于气流阻塞,吸气肌,特别是膈肌负荷增加,进而刺激膈肌肌肉纤维中活性氧（excessive reactive oxygen species,ROS）的过度表达,诱发膈肌细胞凋亡,加剧膈肌疲劳的发生发展。已知凋亡是细胞死亡的一种调节机制,半胱天冬酶（caspase）是细胞凋亡必不可少的途径。caspase属于半胱氨酸蛋白酶家族,其参与天冬氨酸基序的切割。caspase-9为上游“引发剂”,通过激活caspase前体以放大死亡信号而发挥蛋白水解级联启动子的作用。caspase-3为下游“效应子”。在大多数情况下,caspase活化对于细胞凋亡是必不可少的。蛋白激酶B（Protein kinase B,PKB/Akt）是一种细胞内丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。Akt在肌肉蛋白合成中起决定作用。与非恶病质患者和健康对照相比,Akt活性在相对恶病质患者中增加。骨骼肌消瘦和功能障碍是与COPD相关的一种常见疾病,推测Akt可能参与COPD膈肌萎缩以及细胞凋亡的调控作用。COPD患者的膈肌功能障碍目前尚无有效的药物治疗。目前有研究表明抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸可改善缺氧所致的膈肌功能障碍。而黄芪甲苷Ⅳ（Astragaloside Ⅳ,AS-Ⅳ）是从黄芪中提取的一种中药活性成分,也同样具有抗氧化等作用。由于其抗氧化、抗凋亡、抗癌和神经保护功能,被用于治疗多种疾病。研究显示,AS-Ⅳ通过抑制活性氧（Reactive oxygen species,ROS）产生和抑制凋亡途径来保护神经细胞免受神经毒性作用。因此我们提出科研假说:AS-Ⅳ对COPD膈肌细胞过度凋亡可能有抑制作用,AS-Ⅳ可能通过Akt通路来调节细胞凋亡过程。本研究拟从动物实验和细胞学两个方面来探讨AS-Ⅳ对COPD膈肌细胞过度凋亡的影响及可能的机制。为临床COPD患者膈肌功能障碍的治疗提供新的靶点和思路。方法:1.本研究采用密闭臭氧箱,以2.5ppm浓度熏蒸小鼠,每天三次,每次一小时,连续六周后处死,取肺组织进行HE染色,建立COPD小鼠模型。实验分为6组。对照组:正常小鼠,腹腔注射生理盐水2ml,每天一次,连续6周;COPD组:COPD小鼠,腹腔注射生理盐水2ml,每天一次,连续6周;COPD+AS-Ⅳ10mg/kg组:腹腔注射,2ml生理盐水+AS-Ⅳ 10mg/kg,每天一次,连续6周;COPD+AS-Ⅳ 20mg/kg组:腹腔注射,2ml生理盐水+AS-Ⅳ 20mg/kg,每天一次,连续6周;COPD+AS-Ⅳ 40mg/kg组:腹腔注射,2ml生理盐水+AS-Ⅳ 40mg/kg,每天一次,连续6周;COPD+Akt抑制剂+AS-Ⅳ 40mg/kg组:腹腔注射,2ml生理盐水+Akt抑制剂30mg/kg+AS-Ⅳ 40mg/kg,每天一次,连续6周。深麻醉后取肺组织及膈肌,进行苏木精和伊红染色观察肺和膈肌组织的病理变化,并用末端脱氧核苷酸转移酶d UTP缺口末端标记法检测膈肌细胞凋亡数量。免疫组化和western blot检测Akt、磷酸化Akt（phosphorylated Akt,p-Akt）、caspase-3和caspase-9的相对蛋白表达水平。2.取新生大鼠膈肌细胞,用白细胞介素-8（IL-8）刺激,并分别给予AS-Ⅳ浓度（5、10或40 mg/L）和Akt抑制剂GSK690693。实验分为6组。对照组:正常培养,不处理细胞;IL-8组:含50ng/ml IL-8的培养基处理细胞;IL-8+AS-Ⅳ5mg/L组:含50ng/ml IL-8+5mg/L AS-Ⅳ的培养基培养细胞;IL-8+AS-Ⅳ10mg/L组:含50ng/ml IL-8+10mg/L AS-Ⅳ的培养基培养细胞;IL-8+AS-Ⅳ40mg/L组:含50ng/ml IL-8+40mg/L AS-Ⅳ的培养基培养细胞;IL-8+Akt抑制剂组:含50ng/ml IL-8+10u M GSK690693的培养基培养细胞。48h后分别用细胞计数试剂盒-8和western blot检测细胞增殖和Akt磷酸化（p-Akt）。流式细胞仪检测细胞凋亡和ROS生成。采用caspase比色法和ELISA法分别检测caspase活性和促炎因子（肿瘤坏死因子-α、IL-6和IL-8）浓度。结果:1.在动物实验中,AS-Ⅳ可以抑制臭氧刺激的COPD小鼠膈肌凋亡。首先建立了臭氧熏蒸的小鼠COPD模型。与正常对照组肺泡平均截距（56.70±6.05）相比,COPD模型小鼠肺泡腔明显扩大,肺泡壁断裂,破坏,肺泡平均截距（83.13±9.61）显著增宽（P＜0.001）。COPD小鼠膈肌组织的发生断裂,膈肌细胞存在凋亡现象。予AS-Ⅳ 40mg/kg后,膈肌断裂现象及凋亡细胞数明显改善,COPD组小鼠膈肌细胞凋亡率（0.161±0.125）vs.COPD+AS-Ⅳ 40mg/kg组（0.227±0.133）（P＜0.01）。Akt抑制剂干预后,AS-Ⅳ治疗效果下降,而Akt抑制剂组抑制了AS-Ⅳ对膈肌凋亡的改善作用。免疫组化结果显示,COPD组、COPD+AS-Ⅳ 20mg/kg组、COPD+Akt抑制剂+AS-Ⅳ 40mg/kg组的Akt表达较对照组有显著差异（P＜0.05）。模型组的p-Akt表达水平较对照组显著降低（P＜0.001）,而caspase-3和caspase-9表达水平显著升高（分别为P＜0.001）。在COPD+AS-Ⅳ各组中,p-Akt表达水平显著升高,而caspase-3和caspase-9表达水平显著降低（分别为P＜0.05）。这些结果显示了剂量-反应关系。在当AS-Ⅳ和Akt抑制剂同时使用时,p-Akt表达水平显著降低（P＜0.001）。进一步用Western Blot分析AS-Ⅳ对各种蛋白影响,结果显示六组Akt表达无显著差异（P＞0.05）。模型组p-Akt表达水平明显低于对照组,后者caspase-3和caspase-9表达水平较前者高（分别为P＜0.001）。AS-Ⅳ组的p-Akt表达水平与模型组相比显著升高,而caspase-3和caspase-9表达水平与模型组相比显著降低（分别为P＜0.05）。这些结果显示了剂量-反应关系。与AS-Ⅳ组相比,AS-Ⅳ+Akt抑制剂组的p-Akt表达水平显著降低（P＜0.05）。提示p-Akt可能在其中存在调控作用。进一步提示AS-Ⅳ可能是改善膈肌细胞凋亡,改善膈肌疲劳的有潜力的药物。2.在细胞学实验中,AS-Ⅳ可以抑制IL-8刺激的大鼠膈肌细胞的凋亡。首先筛选合适的IL-8浓度进行实验,选择10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml的IL-8膈肌细胞,发现50ng/ml的IL-8处理膈肌细胞48h时增殖抑制显著,而浓度过高,则抑制过度导致细胞过少。故后续实验选择50ng/ml IL-8作为后续实验浓度（对照组0.584±0.009,vs.50ng/ml IL-8组0.311±0.013,P＜0.001）。其次选择合适的AS-Ⅳ浓度进行后续试验,选择AS-Ⅳ 2.5mg/L、AS-Ⅳ5mg/L、AS-Ⅳ 10mg/L、AS-Ⅳ 20mg/L、AS-Ⅳ 40mg/L、AS-Ⅳ 80mg/L分别处理大鼠IL-8处理的大鼠膈肌细胞,发现48h后2.5mg/L不能改善IL-8的抑制细胞增殖状态。而随着浓度增加,膈肌细胞增殖被抑制程度降低,而AS-Ⅳ 80mg/L和40mg/L对细胞增殖影响相似,因此最终选择AS-Ⅳ 5mg/L、10mg/L和40mg/L作为后续实验浓度。第三,分别用AS-Ⅳ 5mg/L、10mg/L和40mg/L和Akt抑制剂干预IL-8刺激的膈肌细胞,观察到膈肌细胞早期凋亡率增加（对照组1.8±0.89 vs.IL-8组33.47±1.52,P＜0.001）,ROS产生增多（对照组5556±114 vs.26821±306,P＜0.001）,p-Akt、caspase-3/caspase 9活性、和促炎因子（TNF-a、IL-6、IL-8）产生升高（IL-8组vs.对照组P＜0.05）。IL-8组与AS-Ⅳ40mg/L组比较,caspase-3活性（IL-8组13.398±0.097 vs.AS-Ⅳ40mg/L组8.185±0.583,P＜0.001）,caspase-9活性（11.920±0.293 vs.7.381±0.248,P＜0.001）,活性氧（reactive oxygen species,ROS）（26821±306 vs.13865±650,P＜0.001）,p-Akt蛋白表达（0.454±0.028 vs.0.248±0.023,P＜0.001）,AS-Ⅳ治疗逆转了IL-8的作用。AS-Ⅳ的作用呈剂量依赖性。而Akt抑制剂削弱了AS-Ⅳ的作用,提示AS-Ⅳ具有抗氧化、抗凋亡和抗炎作用,Akt途径可能参与了其作用机制,AS-Ⅳ是治疗膈肌疲劳的候选药物。结论:COPD膈肌功能障碍与膈肌细胞过度凋亡有关。臭氧诱导的小鼠COPD模型显示膈肌细胞存在过度凋亡,caspase3、caspase9、和p-Akt的活性改变,而AS-Ⅳ可以改善臭氧诱导的COPD小鼠的膈肌过度凋亡及caspase3、caspase9、和p-Akt的活性;在细胞实验中也证实了AS-Ⅳ也可以抑制IL-8诱导的膈肌细胞凋亡,ROS和促炎因子水平的增高,与激活p-Akt活性途径有关,提示AS-Ⅳ可能是治疗COPD膈肌功能障碍有潜力的药物。