一、背景： 骨肉瘤是一种多见于青少年的原发性恶性肿瘤,约60％以上患者手术时已有微小远处转移灶,即使临床采用截肢等扩大性手术,仍有90％患者术后5年内死于肿瘤局部复发或远处转移。新辅助化疗方法的应用虽然使患者5年生存率达到70-80％。但此法存在较大毒副作用及多药耐药性。因此,寻找作用强、毒性低的抗骨肉瘤药物成为目前骨肉瘤主要研究热点之一。骨肉瘤是典型的富血管恶性肿瘤,并且有研究证实骨肉瘤内存在VM。因此,抗骨肉瘤血管生成、血管生成拟态(VM)为提高其综合治疗效果开辟了一条新途径。前期研究表明,蜂毒素在体外可抑制骨肉瘤细胞的增殖。但对蜂毒素抗骨肉瘤血管生成、VM的研究未见报道。因此,本课题以成骨肉瘤UMR-106细胞、ECV304人脐静脉内皮细胞、鸡胚绒毛尿囊膜模型和裸鼠胫骨原位骨肉瘤模型为研究对象,从体内和体外两方面研究蜂毒素抗骨肉瘤血管生成、VM的作用和机制。 二、目的： 本课题拟采用细胞和分子生物学等方法,观察蜂毒素对血管内皮细胞体外增殖、迁移和小管形成的影响,观察蜂毒素体外对骨肉瘤细胞增殖和VM的影响；通过裸鼠胫骨移植瘤模型研究蜂毒素抑制骨肉瘤血管生成和VM的机理,重点阐明抑制血管生成、VM与诱导骨肉瘤细胞凋亡的相关性；评估蜂毒素体内抗骨肉瘤作用和毒副作用,为蜂毒素临床治疗骨肉瘤提供实验依据。 三、方法： 第一部分：蜂毒素体外抗血管生成、血管生成拟态(VM)的实验研究 1.蜂毒素体外抗血管生成的实验研究:MTT法检测不同浓度蜂毒素(分本底对照、空白对照组及0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0μg/ml共8组)对人脐静脉内皮细胞株ECV304增殖的影响,并计算半数抑制浓度；运用划痕实验、Transwell小室趋化实验及细胞三维培养实验,研究蜂毒素(分空白对照组、2.0、4.0、8.0μg/ml共4组)对ECV304细胞迁移和小管形成的影响；运用流式细胞仪检测蜂毒素对ECV304细胞的细胞周期及凋亡的影响。 2.蜂毒素体外抗骨肉瘤VM的实验研究:MTT法检测蜂毒素对骨肉瘤UMR-106细胞增殖的影响；骨肉瘤细胞三维培养实验观察蜂毒素对UMR-106细胞VM形成的影响。 第二部分：蜂毒素对荷成骨肉瘤裸鼠的治疗作用和毒副反应。 建立裸鼠荷SD大鼠成骨肉瘤胫骨原位移植动物模型,肿瘤直径长至0.5cm左右,随机分5组：生理盐水组、蜂毒素低剂量组(160μg/kg/d)、蜂毒素中剂量组(320μg/kg/d)、蜂毒素高剂量组(1600μg/kg/d)、顺铂组(2mg/kg),给药10天。给药结束次日处死裸鼠。裸鼠处死前,摘取眼球取血,测血常规及血清碱性磷酸酶。处死后测量移植瘤长径、短径并称瘤重,计算体积抑瘤率和重量抑瘤率。取一根完整股骨检测骨髓有核细胞数目。取肿瘤、心、肝、脾、肺、肾分别用甲醛或戊二醛固定,石蜡标本和电镜标本制作后,分别在光镜和电镜下观察。 第三部分：蜂毒素抑制骨肉瘤裸鼠移植瘤血管生成及VM的机理研究。 骨肉瘤裸鼠模型同上,随机分3组：生理盐水组、蜂毒素组(320ug/kg)、顺铂组(2mg/kg),给药10天。处死后通过采用免疫组化因子,Western Blot检测、图象分析定量方法,原位末端标记技术等方法,检测蜂毒素对裸鼠骨肉瘤血管生成和VM相关的VEGF、bFGF、TGF-β1、HIF-1a、COX-2、MMP-2等相关因子的表达,检测蜂毒素对骨肉瘤细胞增殖指数,细胞凋亡指数的影响。着重阐明蜂毒素抑制血管生成、抑制VM的机理及其与诱导骨肉瘤细胞凋亡的相关关系。 四、结果： 第一部分： 1.蜂毒素体外抗血管生成的实验研究:MTT结果显示,蜂毒素对ECV304增殖具有显著的抑制作用,并呈浓度依赖关系；划痕闭合实验结果显示,蜂毒素各组划痕损伤区发生迁移的细胞数目显著少于空白对照组,并且随着药物浓度的增加,迁移细胞数目逐渐减少:Transwel小室趋化实验结果显示,蜂毒素在2μg/ml～8μg/ml范围内,随着浓度增加ECV304细胞迁移数目明显减少,迁移抑制率明显增加,与空白对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01);流式细胞仪检测结果表明,随着蜂毒素浓度的升高,S期ECV304细胞比率逐渐增加,与空白对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01),G0/G1期细胞比率减小,蜂毒素可诱导ECV304细胞凋亡,呈现浓度依赖性；小管形成实验结果表明,与空白对照组比较,蜂毒素各组形成管状结构数目和小管间距离加大,管状结构不完整,管状结构面积和周长减小(P<0.01)。 2.蜂毒素体外抗骨肉瘤VM的实验研究:MTT结果显示,蜂毒素对UMR-106骨肉瘤细胞增殖具有显著的抑制作用,也具有浓度依赖关系；管状形成实验结果显示,蜂毒素2.0μg/ml组,UMR-106细胞仅能够形成条梭状和长条形,但不能形成VM;蜂毒素4.0、8.0μg/ml组,UMR-106细胞不能形成长条形和梭形,细胞很难向凝胶内层延伸,悬浮细胞及细胞碎片增多。 第二部分：结果显示,蜂毒素中、高剂量组肿瘤体积及重量明显小于生理盐水组(P<0.01或P<0.05),蜂毒素对肿瘤生长的抑制作用呈现剂量依赖性；蜂毒素中、高剂量组血清AKP浓度明显低于生理盐水组(P<0.01或P<0.05)。光镜和电镜下见蜂毒素组瘤体发生不同程度的坏死,而生理盐水组却未见明显坏死。蜂毒素各组裸鼠外周血细胞、骨髓有核细胞未见明显改变。高剂量蜂毒素组肾脏可见肾小管间质血管扩张充血,肾细胞间隙炎性细胞聚集,其他各组肝、心、脾、肺、肾未见明显的病理变化。 第三部分：免疫组化检测显示,蜂毒素组微血管密度、血管拟态密度、PCNA、VEGF、bFGF、TGF-β1、COX-2、HIF-1a和MMP-2蛋白表达均明显低于生理盐水组(P<0.01)。TUNEL法检测骨肉瘤内细胞凋亡结果显示,蜂毒素组细胞凋亡率明显增加；免疫印迹(Western blot)检测结果显示,蜂毒素组VEGF、HIF-1a和MMP-2蛋白条带灰度值明显低于生理盐水组(P<0.01)。 五、结论： 1.蜂毒素体外可抑制人脐静脉ECV304细胞的增殖、迁移、管状结构形成能力,其机制可能与其诱导内皮细胞凋亡和干扰细胞周期的正常移行有关。蜂毒素体外可抑制UMR-106成骨肉瘤细胞的增殖、拉长变形和管状结构形成能力。 2.蜂毒素对UMR-106成骨肉瘤细胞裸鼠胫骨移植瘤的生长具有显著的抑制作用,抑制骨肉瘤组织内细胞增殖,诱导其调亡和坏死,降低裸鼠血清AKP水平。并且对骨髓、心、肝、肺及肾等脏器无明显毒副作用。 3.蜂毒素体内能够降低UMR-106成骨肉瘤细胞裸鼠胫骨移植瘤的血管生成和血管生成拟态密度,并且骨肉瘤血管生成、VM密度与骨肉瘤细胞凋亡呈负相关,与细胞增殖呈正相关。这可能是小剂量蜂毒素抑制骨肉瘤生长的机制之一。 4.蜂毒素对HIF-1a和MMP-2的影响是其抑制血管生成、VM的基础；对VEGF、bFGF、TGF-β1的影响是抑制血管生成的主要因素；COX-2是蜂毒素抑制血管生成、VM的中间环节。在这些调控因子之间,HIF-1a和MMP-2充当着重要角色。