第一部分:视网膜小胶质细胞在大鼠视网膜光损伤模型中的作用选用成年雄性SD大鼠,予缝线开睑,1%阿托品扩瞳,经24h暗适应后,放入光照箱中接受24 h强度为2500Lux的宽谱蓝光照射。在光照后的3d、7d、14d应用光镜、TUNEL染色、透射电镜观察实验大鼠视网膜组织结构的改变及细胞凋亡情况;应用闪光ERG评价视网膜功能。结果显示:光照后视网膜光感受器的内外节破坏,外核层排列紊乱,核质固缩,核层逐渐变薄,14d时减少达60.09%;光照后1d,外核层出现大量TUNEL(+)细胞,进一步经透射电镜证实光感受器的死亡方式为凋亡;光照后14d,视网膜功能显著下降,OdB光照强度不能诱导出Photic-ERG波形;模型眼出现与视网膜色素变性相似的以凋亡为特征的光感受器变性。在成功建立了大鼠视网膜光损伤模型后,我们又进一步研究了实验性视网膜光损伤模型中小胶质细胞的迁移、活化及其与光感受器凋亡的关系。光照后2h、6h、1d、3d、7d、14d,采用免疫荧光染色观察两组大鼠视网膜OX42(+)细胞(小胶质细胞)的形态改变、迁移活动,并对视网膜外层的TUNEL(+)细胞和OX42(+)细胞分别计数并绘制时间变化曲线,分析两者的关系,同时用ED1抗体寻找可能的血源性巨噬细胞;用透射电镜观察进入光感受器层的小胶质细胞的吞噬行为;用Real-time PCR和Western-blot法对光照后视网膜胶质源性致炎因子及神经毒性物质IL-1βmRNA及蛋白表达变化进行定量分析。结果显示:光照后2h视网膜外核层即可见TUNEL(+)细胞,1d时达高峰,3d后逐渐减少;光照后6h视网膜外核层开始出现少量OX42(+)细胞,逐渐增多并于3d时达高峰,7d后渐消失,从时间变化曲线可见OX42(+)细胞的迁移高峰落后并紧随凋亡高峰;视网膜铺片中见OX42(+)细胞由呈小细胞体和细的分支突触的静息形态转变为肥大细胞体的激活形态;强光照射上调了视网膜IL-1βmRNA及蛋白的表达,其时间变化趋势同小胶质细胞的激活和迁移趋势基本一致;透射电镜显示进入外核层的小胶质细胞吞噬了光感受器的外节膜盘;光照后的晚期由于血视网膜屏障的破坏,极少量的血源性巨噬细胞向视网膜外层浸润。本部分的研究发现视网膜光损伤模型中光感受器的凋亡诱导了小胶质细胞向外层的迁移、活化及吞噬行为的发生,并伴有胶质源性神经毒性物质IL-1β的上调,提示小胶质细胞在加速光感受器变性过程中发挥着重要的作用。第二部分:纳洛酮对脂多糖诱导的视网膜小胶质细胞激活的影响原代培养并分离纯化视网膜小胶质细胞,利用脂多糖(LPS)建立体外激活模型,分为接受不同浓度(-)-naloxone及其异构体(+)-naloxone预处理的实验组和对照组,采用OX42免疫荧光染色观察naloxone对LPS激活的视网膜小胶质细胞形态的影响;用酶联免疫吸附试验检测naloxone对LPS激活的小胶质细胞分泌IL-1β的影响;用MTT比色法观察naloxone对LPS激活的小胶质细胞增殖的影响。实验结果显示:LPS活化的小胶质细胞呈典型的激活形态,表现为胞体显著增大,胞膜突起变粗、皱褶,OX42阳性染色明显增强,呈“水母状”,1μM的(-)-naloxone及其异构体(+)-naloxone预处理30min则显著抑制了LPS引起的此种形态学变化,表现为更接近于对照组的轻度激活形态;此外naloxone预处理能显著减少LPS引起的小胶质细胞释放IL-1β的增多,从量效曲线上看,naloxone对LPS引起的小胶质细胞释放IL-1β的抑制作用呈一定的剂量依赖性和时间依赖性,以1μM、12h效果最为明显,且异构体具有等效性;MTT比色法显示0.25μM～1.25μM naloxone对≤100ng/ml LPS处理的小胶质细胞的数量无明显影响。本部分的研究发现naloxone能够有效抑制LPS活化的视网膜小胶质细胞的形态变化及IL-1β的产生;一定浓度下的naloxone对LPS活化的小胶质细胞的增殖无明显影响,提示功能抑制;naloxone及其异构体对抑制活化的小胶质细胞的形态变化及IL-1β的产生具有等效性,提示其抑制作用可能与阿片受体无关。第三部分:纳洛酮对视网膜光损伤模型中光感受器变性的神经保护作用SD大鼠接受2500Lux的宽谱蓝光照射24h制成光损伤模型。实验组大鼠于光照前2d接受不同剂量naloxone腹腔注射直至光照后2周,而对照组则接受等量的PBS腹腔注射。用组织学和视觉电生理的方法来评价naloxone对光照引起的光感受器变性的神经保护作用;用TUNEL染色观察naloxone对光照后光感受器凋亡的影响;用免疫荧光染色观察视网膜OX42(+)细胞(小胶质细胞)的迁移活动,用Western-blot来检测光照后视网膜IL-1β蛋白含量的变化。结果显示PBS治疗组在光照后的14d,视网膜外核层显著变薄,而接受1mg/dnaloxone腹腔注射的实验组无论是上方或下方的视网膜其外核层厚度都得到了较好的保留,后极部尤其明显。Naloxone的神经保护作用显示了良好的剂量依赖性,其中又以1mg/day效果最为理想;而在相同的时间点,naloxone治疗组其ERG最大混合反应的a波、b波振幅较光照前自身基线水平的下降程度均较对照组低;免疫荧光染色显示naloxone处理组迁移入外核层的小胶质细胞数较对照组明显减少,而视网膜IL-1β蛋白水平在两组间的差异也与此吻合;TUNEL染色显示naloxone能够减少光照后3～7d光感受器的凋亡。本部分的研究发现naloxone能够延缓强光照射引起的后期光感受器的变性过程,其机理可能在于抑制了视网膜小胶质细胞的活化。