本文以我国主要经济红藻之一条斑紫菜为主要对象,首先系统研究多种因素对其中所含藻红蛋白制备的影响,包括藻体破碎、藻红蛋白粗提、粗提液脱盐和层析、制备规模的逐步放大等,其次对所得藻红蛋白做光学性质和结构鉴定,包括摩尔消光系数、荧光量子产率、光漂白时间的测定,蛋白亚基核苷酸和氨基酸结构的预测,以及蛋白的结晶衍射分析,最后研究了藻红蛋白抑制肿瘤细胞的效果,包括蛋白光动力抑制效果,蛋白诱导细胞凋亡的形态学观察,以及细胞凋亡代谢途径分析。主要研究结果如下:1.系统研究多种因素对条斑紫菜藻红蛋白制备的影响（1）研究藻体破碎的影响因素,如物液比、缓冲液浸泡时间等。结果表明在物液比为1:5,浸泡时间为36h时,采用“溶胀+组织捣碎”法破碎条斑紫菜叶状体细胞综合效果最佳。（2）研究藻红蛋白粗提的影响因素。依次研究活性炭、利凡诺等化学试剂和等电点、溶液浓度、pH值、温度、差速离心等物理条件对条斑紫菜破碎液中藻红蛋白纯度和产率的影响。结果显示:小量活性碳与利凡诺的结合使用不能提高藻红蛋白纯度,单独使用活性碳,随用量提高,其纯度上升,在紫菜/活性碳=5/1（g/g）时效果最佳。藻红蛋白等电点沉淀后纯度反而下降,但pH调节与硫酸铵沉淀结合可显著提升纯度,且与原溶液浓度成正比,藻红吸收光谱纯度最高达到1.35。此外,盐析过程中差速离心还可继续提升纯度,达到1.42,而通过控制温度来变性蛋白的方法不能达到提纯的效果。而粗提液采用硫酸氨盐析方法后,经过四次盐析后的藻红蛋白纯度达到1.71。（3）研究粗提液脱盐和层析及制备规模放大的影响因素。以蛋白盐析液为原料,在综合比较脱盐效率后,从Sephadex G-25、G-100、S-300和CL-6B中选择G-25作为实验流程中的脱盐填料,并将原料条斑紫菜量逐步放大,选取了1g、20g、100g、400g和2000g五个梯度。结果表明随着初试紫菜量逐步放大,最终所得藻红蛋白中纯度大于3.2的蛋白产率依次提高,其中400g冻干紫菜经多次硫酸铵盐析和一次羟基磷灰石层析后的产率为0.323%,2000g冻干紫菜经过一次羟基磷灰石层析后获得纯度大于3.2的藻红蛋白的产率为0.184%,再经一次同样层析可获得纯度大于4.5的蛋白产率为0.109%。所得蛋白做了吸收光谱、荧光发射光谱、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,显示均达到商品化要求。由此认为本实验工艺流程具有规模放大的潜力,这为高纯度藻红蛋白的规模生产提供了一条可行的方案。2.研究条斑紫菜藻红蛋白光学性质和结构（1）测定了藻红蛋白的摩尔消光系数、荧光量子产率和光漂白时间。该蛋白摩尔消光系数经Folin-酚法和Bradford法测定分别为1.79mL·（mg·cm）^-1和1.73 mL·（mg·cm）^-1,20℃时在505 nm处的荧光量子产率为0.90,在日光灯、发光二极管、碘钨灯和激光四种光源下的光漂白效果以激光最显著,240μg·mL^-1藻红蛋白10min光漂白率可接近碘钨灯辐照240min的值。（2）对藻红蛋白α（Pea）和β（Peb）亚基基因进行了克隆、序列测定及分析。根据已发表的基因序列（DQ666487.1）设计引物,对提取自条斑紫菜叶状体的DNA进行Polymerase Chain Reaction（PCR）和电泳鉴定,产物经测序证实获得藻红蛋白序列1 357bp （HM008263.1）,该序列与已报道的条斑紫菜相关序列（DQ666487.1）同源性均为99%,与其他几种紫菜相关序列同源性自88%～98%不等。序列采用多顺反子转录策略,排布顺序为5′UTR- Peb -间隔区- Pea -3′UTR。对基因翻译所得氨基酸序列做了理化参数、功能位点及空间构型的预测。并基于序列开放阅读框、启动子、Shine-Dalgarno （SD）序列的分析对条斑紫菜分类地位进行了讨论。（3）对藻红蛋白做结晶衍射分析。结果显示藻红蛋白晶体属于R3空间群,如果按照六方晶胞取其晶胞参数,为a = b = 187.7 （?）,c = 59.7 （?）,α=β=60°,γ=120·。根据Matthews常数计算结果,当一个不对称单位中含有两个（αβ）二聚体时,对应的Matthews常数为2.81 （?）3/Da,溶剂含量为56%。用程序MOLREP计算了自身旋转函数来分析非晶体学对称性。在X= 180o截面上的峰说明存在非晶体学对称性二重轴,这个二重轴位于在xy平面上,与x轴夹角55度,并且与X= 120°截面上的晶体学三重轴垂直。用已知藻红蛋白结构（PDB编号1EYX）作为搜索模型,使用CCP4程序包中的Phaser程序进行相角解析的尝试,得到一个显著的解,得到模型用REFMAC5进行了刚体修正,得到R = 0.30,Rfree = 0.28。3.研究条斑紫菜藻红蛋白抑制肿瘤细胞效果（1）研究藻红蛋白光动力抑制人肝癌BEL-7402细胞和SMMC-7721细胞的效果。结果显示在发光二极管介导的光动力处理组中,蛋白浓度在2 5μg·mL^-1以下的实验组与空白对照结果相近,即使蛋白浓度加到100μg·mL^-1,BEL-7402细胞存活率依然为87%。相比之下,添加蛋白后经碘钨灯或激光辐照对细胞的杀伤效果较为明显。在大于120μg·mL^-1的蛋白介导的激光作用下,两种细胞的存活率不到30%。（2）观察藻红蛋白光动力诱导人肝癌BEL-7402细胞凋亡的形态学变化。实验将蛋白介导的激光动力作用的细胞经JC^-1或Annexin V- PI试剂盒染色后在荧光显微镜下观察,或用DNA Ladder试剂盒处理后电泳分析。结果显示,与对照组相比,实验组细胞在处理后2h的JC^-1染色偏向绿色,Annexin V-fluorescein isothiocyanate染色较明显,而碘化丙啶染色不明显,且经电泳出现了DNA Ladder,表明细胞发生了凋亡。（3）分析藻红蛋白光动力诱导人肝癌BEL-7402细胞凋亡的代谢途径。蛋白介导的激光动力作用细胞后用TRIZOL法提取RNA,反转录成cDNA进行荧光定量PCR,检测凋亡基因表达量变化。结果显示光动力作用使细胞倾向于凋亡,而对照组（单用PE或单用激光）影响不大。根据实验数据推导出的各组细胞凋亡或抑制凋亡的代谢途径如下:对于光动力作用组,当PE进入细胞并被激光激发后,细胞膜和内质网被破坏,使大量钙离子进入胞浆,进而激活白细胞介素-3受体,后者诱导产生Bax,导致细胞色素C的释放,最终激活内源性细胞凋亡通路。此外,光动力学治疗会使细胞缺氧并产生一氧化氮,从而激活p53基因,并诱导Bid的表达,从而增强了内源性细胞凋亡代谢通路,这种推测以实验中p53, Bid, Bax, Caspase-9和Caspase-3在光动力学治疗后2h的高表达为依据。在单用蛋白或单用激光的对照组中,辐照、热激及光敏剂本身均可激活Cdc42/Rac和p53基因,前者进一步激活p38丝裂原活化蛋白激酶信号通路并起始了Fas相关死亡域蛋白相关的外源性细胞凋亡代谢通路。但另一方面,Cdc42也可激活Classkal丝裂原活化蛋白激酶信号通路并诱导产生X连锁凋亡抑制蛋白,后者可抑制特定caspases家族基因来阻断细胞凋亡。在这种情况下,p53蛋白激活DNA修复蛋白并使细胞分裂暂停于G1/S点,从而使DNA修复蛋白有足够时间来修复破损DNA,以保证细胞的存活。而Classkal丝裂原活化蛋白激酶信号通路在光动力学组中可能因细胞内受损严重而被阻断,这可从caspases家族的基因表达含量变化中获得依据。