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目的:建立稳定的重亚硫酸盐测序(Bisulfite-sequencing PCR,BSP)检测平台,检测人类永生化肝细胞LO2中凝血因子Ⅷ(Coagulation factorⅧ,FⅧ)基因5′端CpG岛的甲基化水平,对比检测正常人新鲜肝组织及L-Arg刺激的LO2细胞FⅧ甲基化CpG岛的状态,探究甲基化的CpG岛对FⅧ表达的调控作用。 方法:Methprimer软件预测FⅧ基因启动子上游的CpG岛,将第一个CpG岛划分为三个独立片段:CpG is1-1、CpG is1-2及CpG is1-3;第二个CpG岛为一个完整片段:CpG is2。并设计BSP引物。运用BSP联合TA克隆、蓝白斑筛选及质粒PCR,验证十个阳性单克隆并送测序,BiQ Analyzer软件对测序结果进行甲基化位点分析,以(甲基化CG位点个数)/(甲基化CG位点个数+非甲基化位点个数)计算各个CpG位点的甲基化率。RT-PCR检测LO2细胞、正常人肝组织及L-Arg刺激的LO2细胞FⅧ的转录水平,BSP检测正常人肝细胞及L-Arg刺激的LO2细胞CpG is2的甲基化状态,SPSS软件分析三者之间CpG is2的单个CpG位点甲基化率的差异。 结果:人FⅧ基因5′端存在两个CpG岛:CpG island1位于-4879─-4071,全长809bp;CpG island2位于-3600─-3323,全长278bp。LO2细胞中,CpG is1-1共12个CpG位点,整体甲基化率为0%;CpG is1-2共40个CpG位点,整体甲基化率为0-20%;CpG is1-3共27个CpG位点,整体甲基化率为0-20%;CpG is2共23个CpG位点,整体甲基化率为80-100%。RT-PCR结果显示:LO2细胞不转录FⅧ;正常人肝细胞及L-Arg刺激LO2细胞36小时后能检测到FⅧ的转录。对比检测CpG is2甲基化水平,正常人肝组织为70%-100%,L-Arg刺激LO2细胞为60%-100%。LO2细胞、正常人肝组织及L-Arg刺激的LO2细胞CpG is2的整体甲基化的水平两两比较均无统计学意义(p>0.05)。 结论:在人类永生化肝细胞LO2中,FⅧ基因5′端存在一个被高度甲基化的CpG岛。在LO2细胞、正常人肝组织及L-Arg刺激LO2细胞中,FⅧ5′端CpG is2的甲基化水平无明显改变,表明FⅧ基因的表达不依赖其5′端CpG岛的甲基化。