局部麻醉药(局麻药)为临床局部麻醉和疼痛治疗中的常用药物,但该类药物具有潜在的神经毒性。随着神经阻滞麻醉的广泛应用,局麻药引起神经毒性反应的报道逐渐增多,已引起临床工作者高度重视。许多研究发现这种神经毒性与局麻药引起的神经细胞凋亡有关,但其确切机制仍未完全阐明。DNA损伤剂、过氧化物、蛋白质磷酸化的调节因子、钙离子自稳状态氧化氮、神经营养因子等许多因素均可诱导神经细胞凋亡。研究发现,神经细胞凋亡细胞产生特征性形态改变,在DNA降解之前,线粒体膜功能发生紊乱,内膜跨膜电位消失,线粒体内蛋白酶活化物释放,激发各种凋亡相关的代谢变化。细胞内活性氧簇(reactive oxygen species, ROS)的爆发是导致神经细胞急性损伤的主要因素之一。ROS在神经细胞内蓄积时,可破坏细胞内氧化还原动态平衡,损伤线粒体膜；此外,ROS可直接与蛋白、脂质、核酸等发挥作用使其失去功能,亦可起中间信使作用,进一步引发神经损伤。研究表明,布比卡因可使Schwann细胞内ROS爆发,触发细胞凋亡。但局麻药罗哌卡因诱发的神经毒性是否与ROS产生和介导有关,目前尚不清楚。本科研小组前期研究发现,布比卡因可能通过干扰神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y氧化磷酸化和抑制线粒体呼吸链复合物Ⅰ,使ATP生成减少,导致单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)持续激活,并引起细胞内部分线粒体的ROS产生和释放增多,通过ROS诱导ROS释放机制使ROS爆发,从而导致细胞损伤和凋亡；进一步发现布比卡可通过激活p38丝裂原活化蛋白激酶(p38mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)途径和线粒体Cl-通道诱发神经细胞凋亡。罗哌卡因和布比卡因同属酰胺类局麻药,理化性质相似,但两者的作用并不完全相同,但罗哌卡因脂溶性小于布比卡因,其心脏毒性作用显著弱于布比卡因,且胎儿对该药具有良好耐受性。因此,罗哌卡因在临床中应用逐渐增多,尤其适用于术后镇痛和产科麻醉。但罗哌卡因仍有潜在的神经毒性,研究罗哌卡因引发的神经毒性损伤机制,减少与避免神经并发症具有重要的临床意义。以往研究认为罗哌卡因不影响纤维母细胞ROS的生成,但罗哌卡因对SH-SY5Y细胞的ROS是否有影响?目前国内外尚未报道。如果罗哌卡因能诱发SH-SY5Y细胞内ROS增多,若与布比卡因比较,何者作用更强?其导致细胞凋亡的主要作用靶点又是什么?这些机制均有待深入研究。ROS是导致DNA损伤的重要因素,DNA损伤后修复的机制错综复杂,DNA损伤与修复直接关联到细胞结构与功能的恢复,因而受到日益重视。局麻药在神经细胞引起的氧化应激后DNA的损伤及修复机制是如何?目前尚不明确。有研究发现,8-氧鸟嘌呤(8-oxoguanine,8-oxoG)是由大量ROS直接攻击细胞DNA中的鸟嘌呤(dG),使脱氧鸟苷氧化而产生。8-oxoG是一种前致突变物,在DNA复制时,聚合酶经常将胸腺嘧啶(T)与8-oxoG配对,这样G-C配对就会转变成为A-T配对,A/8-oxoG的错配会导致基因G：C到T：A的突变。DNA链8-oxoG突变修复有两种类型,一种由8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶(8-oxoGuanine DNA Glycosylase,OGG1)负责直接切除8-oxoG;另一种先由MSH2/MYH修复酶切除与8-oxoG配对的A,然后再由OGG1切除8-oxoG从而完成修复过程。机体通过抗氧化防御系统以及DNA修复系统可以有效的抵御活性自由基诱发的DNA损伤,但如果损伤因素过强,超过了机体防御系统的保护能力,DNA修复系统不足以完成全部突变的修复,则会累积起来引起机体一系列异常改变,可导致细胞的凋亡和疾病的发生。我们推测,局麻药引发的神经损伤可能与ROS产生导致8-oxoG突变有关,而负责修复该突变的DNA修复酶OGG1,MSH2和和MYH可能在神经细胞损伤后被激活,并发挥其重要的修复作用,抵御局麻药致神经细胞凋亡的作用。综上所述,本研究拟从细胞水平,应用细胞生物学和分子生物学手段,比较罗哌卡因和布比卡因诱导SH-SY5Y细胞凋亡及ROS爆发的作用；并建立AMPK高表达及低表达细胞株,进一步研究AMPK在罗哌卡因诱导ROS产生中的作用。另外,我们使用氯离子阻断剂4,4’-diisothiocyanatostilbene-2,2’-disulfonic acid disodium(DIDS)及p38MAPK拮抗剂吡啶咪畔化合物SB203580(4-(4-氟苯基)-2-(4-甲基亚磺酰基苯基)-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑)4-(4-Fluorophenyl)-2-[4-(methylsulfinyl)phenyl]-5-(4-pyridyl)-1H-imidazole)预处理SH-SY5Y细胞,研究罗哌卡因对SH-SY5Y细胞线粒体和p38MAPK的影响,以探讨罗哌卡因引发细胞凋亡是否与p38MAPK信号通路和线粒体氯离子通道被激活有关。本课题还将对罗哌卡因致神经损伤后DNA修复系统(包括8-oxoG的产生和DNA修复酶hOGG1,hMYH和hMSH2酶)的作用做初步的研究,探讨该系统在罗哌卡因致神经损伤后修复中的作用,为预防临床中罗哌卡因引起的神经毒性及开发有效的治疗药物提供重要的理论依据。目的探讨罗哌卡因和布比卡因诱发SH-SY5Y细胞产生的ROS水平与其致细胞凋亡的关系。方法以SH-SY5Y细胞为研究对象,分别用含3mmol/L罗哌卡因和3mmol/L布比卡因的培养液处理1、2、3、4、5、6h后,检测细胞内ROS水平；3mmol/L罗哌卡因和3mmol/L布比卡因处理SH-SY5Y细胞4h后,检测细胞活力及细胞凋亡率。计量资料以x±s表示,采用SPSS17.0统计软件分析。不同药物处理组在各时间点测得的ROS水平比较采用析因设计资料的方差分析。细胞活力及凋亡率均采用完全随机单因素方差分析,组间比较采用LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。结果流式细胞术检测结果表明,细胞经3mmol/1罗哌卡因或3mmol/l布比卡因处理后,细胞内ROS水平逐渐增高,均于第4h达高峰(罗哌卡因组ROS为146.07±4.68,布比卡因组ROS为268.06±12.73), ROS水平在第5、6h出现下降趋势。同未处理组比较,药物处理组细胞内ROS水平在第1、2、3、4、5、6h均高于未处理组,差异有统计学意义(P<0.01)。罗哌卡因处理组的ROS水平在各时间点均低于布比卡因处理组,差异有统计学意义(P<0.01)。同未处理组比较,细胞经3mmol/1罗哌卡因或3mmol/1布比卡因处理4h后,细胞活力明显下降,差异有统计学意义(P<0.01),但罗哌卡因组细胞活力(60.91%±1.91%)明显高于布比卡因处理组(35.91%±1.66%),差异有统计学意义(P<0.01)。未处理组细胞凋亡率为4.44%±0.63%,罗哌卡因组和布比卡因组细胞凋亡率分别为36.34%±2.74%和64.19%±2.99%；经药物处理后,罗哌卡因组或布比卡因组的细胞凋亡率明显增加,与未处理组细胞凋亡率比较,药物处理后细胞凋亡率差异有统计学意义(P<0.01),但罗哌卡因组的细胞凋亡率明显低于布比卡因组,其差异有统计学意义(P<0.01)。结论罗哌卡因与布比卡因均能通过诱发SH-SY5Y细胞ROS增多导致细胞凋亡,但罗哌卡因引发ROS产生的水平较布比卡因低,诱导细胞凋亡的作用较布比卡因弱。目的探讨罗哌卡因能否通过激活AMPK致SH-SY5Y细胞内ROS增多并引发细胞凋亡方法将质粒pGPU6/GFP/Neo-shRNA AMPKa2和pEGFP-N1-AMPKa2转染SH-SY5Y细胞株,细胞分为pEGFP-N1-AMPKa2组(AMPKa2组)pEGFP-N1组(blank组),pGPU6/GFP/Neo-shRNA AMPKa2组(siAMPKa2组),pGPU6/GFP/Neo NC组(NC组)和未转染任何质粒的对照组(control组)。转染重组质粒的SH-SY5Y细胞经3mmol/L罗哌卡因处理4h后,Western blot法检测AMPKα2和磷酸化AMPKα2(p-AMPKa2)蛋白表达。流式细胞术检测各组细胞内ROS水平。MTT检测各组细胞活力、流式细胞术和Hoechst33258染色法检测各组细胞凋亡率。同时,检测未用罗哌卡因处理的各组细胞的上述相同指标。计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS17.0统计软件分析。质粒转染后AMPKα2蛋白表达量采用单因素方差分析,组间比较采用LSD法；罗哌卡因理后细胞活力、ROS水平、p-AMPKα2蛋白表达水平和细胞凋亡率采用两因素析因设计资料方差分析,组间比较采用LSD法(方差齐)或Dunnett’sT3法(方差不齐)。P<0.05为差异有统计学意义。结果转染质粒后,AMPKa2组的AMPKa2蛋白表达显著高于control组(P<0.01),siAMPKa2组的AMPKa2蛋白表达显著低于control组(P<0.01)。罗哌卡因处理后,AMPKa2组的p-AMPKa2蛋白表达显著高于control组(P<0.01),siAMPKa2组的p-AMPKa2蛋白表达显著低于control组(P<0.01)。经罗哌卡因处理后,细胞内ROS含量显著增多,AMPKa2组的ROS水平均高于其它组(P<0.01),差异有统计学意义；siAMPKa2组ROS水平低于blank组、NC组和control组,差异有统计学意义(P<0.01)。MTT检测结果显示罗哌卡因处理后AMPKa2组细胞活力为43.74%±2.27%,低于control组(54.43%±8.17%)(P<0.01)；siAMPKa2组细胞活力(67.22%±2.51%)高于control组(P<0.01)。流式细胞术检测结果显示,罗哌卡因处理4h后AMPKa2组.细胞凋亡率为46.65%±4.44%,高于control组(33.34%±2.80%)(P<0.01) siAMPKa2组细胞凋亡率为21.77%±2.83%,低于control组(P<0.01)Hoechst33258染色法检测显示,经罗哌卡因处理后AMPKa2组出现更多浓染致密的颗粒状荧光、染色质固缩、亮蓝色的凋亡细胞,其凋亡率为46.51%±4.94%,高于control组(33.84%±2.82%)(P<0.01)；siAMPKa2组细胞调亡率为22.70%±2.68%,低于control组,差异有统计学意义(P<0.01)结论SH-SY5Y细胞内AMPKa2过表达可促进罗哌卡因诱导细胞内ROS大量增多并导致细胞凋亡,而下调AMPKa2表达可抑制罗哌卡因诱导细胞内ROS产生和细胞凋亡；罗哌卡因可通过激活AMPK致SH-SY5Y细胞ROS爆发性增多,从而引起细胞凋亡目的探讨罗哌卡因致SH-SY5Y细胞ROS增多,对细胞线粒体C1-通道和p38MAPK的影响,以揭示线粒体C1-通道和p38MAPK信号传导通路在罗哌卡因致SH-SY5Y细胞凋亡中的作用方法将SH-SY5Y细胞随机分为4组：DIDS组、SB203580组、DIDS+SB203580组和无预处理组(Non-pretreated组)。DIDS组、SB203580组和DIDS+SB203580组细胞分别经50μmol/lDIDS、10μmol/1SB203580、50μmol/lDIDS+10μmol/1SB203580预处理30min后用含3mmol/l罗哌卡因的培养液处理细胞,Non-pretreated组用含3mmol/l罗哌卡因的培养液处理细胞。各组细胞经罗哌卡因处理4h后用流式细胞术检测细胞内ROS水平,四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物(5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazole-carbocyanide iodine, JC-1)检测线粒体膜电位,Western blot法检测p38MAPK和p-p38MAPK蛋白表达水平,激光共聚焦显微镜检测线粒体内C1-荧光强度,MTT法检测细胞活力,Hoechst33258染色法和流式细胞术细胞凋亡。同时,未用罗哌卡因处理的各组细胞在相同时间点检测上述相同的指标作为对照。结果罗哌卡因处理后,DIDS组和DIDS+SB203580组细胞内ROS水平低于Non-pretreated组(P<0.01)。流式细胞术检测线粒体膜JC-1聚合体/单体荧光强度比值显示,DIDS组和DIDS+SB203580组分别为0.81±0.02和0.83±0.03,均高于Non-pretreated组(0.52±0.02),差异均有统计学意义(P<0.01)。激光共聚焦显微镜检测线粒体内C1-浓度显示,各组无显著性差异(P>0.05)。Western blot显示,DIDS组和DIDS+SB203580组的p-p38MAPK蛋白表达水平均低于Non-pretreated组。MTT检测显示,DIDS组和SB203580组的细胞活力高于Non-pretreated组(P<0.01),但均低于DIDS+SB203580组(P<0.01)。流式细胞术检测细胞凋亡率显示,罗哌卡因处理后DIDS组、DIDS+SB203580组、SB203580组和Non-pretreated组分别为27.70%±3.71%、17.21%±4.20%、28.13%±3.59%和42.76%±4.77%；SB203580组细胞凋亡率较Non-pretreated组低(P<0.01),但细胞内ROS和JC-1聚合体／单体荧光强度比值与Non-pretreated组的差异无统计学意义(P>0.05)。Hoechst33258染色法检测显示,经罗哌卡因处理后DIDS组、DIDS+SB203580组、SB203580组和Non-pretreated组的凋亡率分别为28.01%±3.08%、16.77%±4.41%、27.15%±2.54%和42.98%±5.69%。结论罗哌卡因引发SH-SY5Y细胞ROS增多后,使线粒体的通透性转移孔开放,导致线粒体膜电位降低、通透性增大和p38MAPK激活,导致SH-SY5Y细胞凋亡；而线粒体C1-通道可能与罗哌卡因诱导的线粒体膜电位下降和细胞凋亡无关。目的本研究拟以SH-SY5Y细胞作为研究对象,观察SH-SY5Y细胞在局麻药罗哌卡因处理后,细胞凋亡与8-oxoG的产生的动态关系,以及8-oxoG和DNA修复酶激活的动态关系；以揭示8-oxoG是否是局麻药罗哌卡因引起细胞DNA损伤的机制之一,DNA修复酶hOGG1, hMYH,和hMSH2酶的激活是否参与了局麻药神经损伤后的DNA修复。方法SH-SY5Y细胞经3mmol/1罗哌卡因处理4h,更换培养基后于0,3,6,12,24h时间点取样,采用荧光抗体标记8-oxoG,激光共聚焦显微镜检测罗哌卡因处理前后各时间点细胞内8-oxoG水平；Western blot检测罗哌卡因处理前及处理后各时间点hOGG1,hMYH,和hMSH2酶的表达变化；流式细胞仪检测各时间点的细胞凋亡率。计量资料以均数±标准差(x±s)表示,采用SPSS17.0统计软件分析。不同时间点的8-oxoG水平,DNA修复酶的表达水平及细胞凋亡率采用单因素方差分析,组间比较采用LSD法(方差齐)或Dunnett’sT3法(方差不齐)。P<0.05为差异有统计学意义。结果8-oxoG水平与3种DNA修复酶的表达水平及凋亡率的变化趋势均具有一致性,与加药前的对照组比较,细胞经罗哌卡因处理4h后,细胞内8-oxoG水平明显升高,于更换培养基后0h达到最高峰,随后8-oxoG水平随时间递增逐渐下降；DNA修复酶hOGG1、hMYH及hMSH2在未经罗哌卡因处理前仅有微量表达,经罗哌卡因处理后,以上3种DNA修复酶表达均明显升高,并于更换培养基后0h达到最高峰,随后3种修复酶的水平随时间推移逐渐下降；罗哌卡因处理后各时间点的细胞凋亡率均明显增高,更换培养基0h后凋亡率达最高峰,其后细胞凋亡率随时间递增逐渐下降。结论8-oxoG可能是局麻药罗哌卡因引起细胞DNA损伤的机制之一,而DNA修复酶hOGG1,hMYH和hMSH2可能在罗哌卡因致细胞DNA损伤的修复过程中起重要作用。