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癫痫(epilepsy)是以神经元异常反复过度同步放电为特征的中枢神经系统临床综合征,它危害人们健康,严重影响患者生活质量,给社会和家庭带来沉重的负担。其病因复杂,发病机制尚未完全明了,对其机制的研究具有重要的意义。朱长庚教授首先提出“神经-免疫-内分泌”网络失衡学说,认为在癫痫发生过程中以神经因素为主,免疫和内分泌因素也参与其中。细胞因子是一组多肽或糖蛋白,其经典功能是介导和调节免疫应答,刺激造血功能,参与组织修复等。但近年的研究表明,免疫因子在神经系统中也有重要作用。神经元和神经胶质细胞都具有细胞因子受体并能合成和分泌多种细胞因子。白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)是两种重要的细胞因子,临床癫痫患者血清中二者含量升高,推测与癫痫发病有关。谷氨酸(glutamate,Glu)和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid ,GABA)分别是脑内最主要的兴奋性和抑制性神经递质,二者共同维持着脑神经元兴奋与抑制的平衡,其平衡失调被认为是癫痫的始发因素之一。一氧化氮(NO)作为很多生理活动中细胞内及细胞间的信使,与许多神经系统疾病的发生有关,被认为是一种神经调质,在声、电及某些致痫剂诱发惊厥后,动物脑内各区一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,NOS)明显升高,表明NO与癫痫发生有关。蛋白激酶A(Protein kinase A,PKA)是细胞内重要的信号转导分子,cAMP是细胞内的“第二信使”,它可激活PKA,后者使细胞内多种蛋白质磷酸化而发挥生物学作用,神经组织内含有高水平的cAMP及其代谢调节酶,对中枢神经系统活动起重要的调节作用,也有研究表明,在癫痫发病中cAMP-PKA信号转导系统参与其过程。此外,神经胶质细胞在癫痫复发中具有重要作用。因此本实验应用免疫细胞化学、电生理脑电检测、Westen blot法、细胞培养及流式细胞仪等技术着重研究IL-1β、IL-6在癫痫发病过程中对神经细胞内信号转导因子、神经递质的影响以及对神经胶质细胞周期的影响,以期了解IL-1β、IL-6与癫痫发病的关系。第一部分: IL-1β或IL-6致痫对大鼠脑内γ-氨基丁酸和谷氨酸免疫反应性的影响谷氨酸(Glu)、γ-氨基丁酸(GABA)分别是哺乳动物中枢神经系统内含量最多的兴奋性和抑制性氨基酸,与癫痫的发病有着直接关系。IL-1、IL-6是两种重要的炎前因子,其中IL-1有IL-1α和IL-1β两种亚型,在脑内主要以IL-1β的作用为主。有研究发现癫痫患者和癫痫动物模型血清中、脑脊液和脑内IL-1β、IL-6的含量明显增高。为探讨IL-1β或IL-6致痫与神经递质的关系。将实验大鼠随机分为6组,即:生理盐水组; IL-1β组; IL-6组,戊四氮组;IL-1ra (IL-1受体拮抗剂)+戊四氮组;地塞米松(dexamethasone ,Dex)+戊四氮组。观察大鼠行为变化,并采用免疫组织化学方法检测大脑皮质及海马内Glu及GABA的表达变化。结果:动物行为学观察,IL-1β组、IL-6组癫痫发作程度达中度;戊四氮组癫痫发作程度达重度。IL-1ra +戊四氮组癫痫发作较戊四氮组明显减轻,地塞米松+戊四氮组无明显癫痫发作。免疫组化染色显示, IL-1β组、IL-6组、戊四氮组Glu表达在大脑皮质及海马较生理盐水组明显升高、GABA表达明显降低,差异具有显著性意义。IL-1ra +戊四氮组及地塞米松+戊四氮组与单纯戊四氮组比较,Glu表达减少,GABA的表达增加,有显著性差异。以上结果表明:IL-1β或IL-6致痫后,通过升高Glu含量,降低GABA的含量,使神经元兴奋性升高,打破了二者的平衡状态,从而促进癫痫的形成和发作的维持。而免疫抑制剂具有拮抗经典致痫剂戊四氮的致痫作用和对Glu、GABA的影响,具有抗痫效应。第二部分:IL-1β或IL-6致痫对大鼠脑电及脑内一氧化氮合酶表达的影响一氧化氮(NO)作为很多生理活动中细胞内及细胞间的信使,与许多神经系统疾病的发生有关。一氧化氮合酶(NOS)是NO的合成酶,NOS可间接反映局部NO的含量。有研究表明:在声、电及某些致痫剂诱发惊厥后,动物脑内各区NOS明显升高。为探讨IL-1β或IL-6致痫对脑内信号通路的影响,将实验动物随机分为6组,即:生理盐水组; IL-1β组; IL-6组; Dex +IL-1β组; Dex+IL-6组;Dex组。采用行为学观察、脑电记录及Western blot等方法观察各组大鼠行为学的改变、脑电的变化、及大脑皮质NOS表达的变化。结果表明:动物行为学观察显示,IL-1β组、IL-6组癫痫发作程度达中度,Dex +IL-1β组,Dex +IL-6组和单纯Dex组则无明显癫痫发作。皮质和海马脑电显示:IL-1β组、IL-6组记录到棘波、尖波、棘-慢复合波等痫样波,对照组、Dex +IL-1β组、Dex +IL-6组则无明显痫样波,单纯Dex组脑电呈不活跃状态。Westren blot结果显示:IL-1β组、IL-6组大脑皮质NOS含量明显高于对照组(P<0.05 ), Dex +IL-1β组、Dex +IL-6组和单纯Dex组与对照组相比,差别均无显著性意义( P>0.05)。以上结果提示:IL-1β或IL-6致痫后使大鼠大脑皮层和海马出现明显的脑电痫样波,免疫抑制剂预处理可有效抑制癫痫波形成。IL-1、IL-6致痫的信号转导可能与NO信号转导通路有关。第三部分:IL-1β或IL-6致痫对脑内蛋白激酶A(PKAcβ)的影响cAMP-PKA(protein kinase A, PKA)途径是细胞内重要的信号转导通路,兴奋性Gs蛋白激活腺苷酸环化酶(adenylate cyclase,AC),使cAMP升高,cAMP通过激活依赖cAMP的蛋白激酶PKA催化底物蛋白质磷酸化,启动一系列级联反应,产生生物效应。所以PKA是细胞内信号转导的重要环节。本实验应用免疫组织化学方法,观察IL-1β或IL-6致痫对大鼠大脑皮质、海马内PKAβ催化亚基(PKAcβ)表达的变化。实验分为4组,即:对照组; IL-1β组; IL-6组,地塞米松组。结果: IL-1β组、IL-6组大鼠均有明显的痫性发作,且海马PKAcβ的免疫反应均明显强于对照组,差异具有显著性意义(P<0.05);地塞米松组大鼠呈抑制状态,且其脑内PKAcβ表达较对照组明显下降(P<0.05)。以上结果提示:IL-1β、IL-6参与致痫,其致痫活动与神经元内PKA介导的信号转导有关,免疫抑制剂可抑制该信号通路,进而可能抑制癫痫发生。第四部分:观察IL-1β或IL-6对大脑皮质星形胶质细胞细胞周期的影响神经系统是由神经元和胶质细胞组成的复杂的网络结构,星形胶质细胞(astrocyte,Ast)与神经元关系密切,不仅起到传统的支持、营养和保护神经元的作用,也积极参与神经系统的发生、发育以及神经系统的疾病过程。因此,神经系统的病变必然影响星形胶质细胞。癫痫发病机制研究的新进展已表明,胶质细胞在癫痫复发中具有重要作用。为探讨IL-1β或IL-6在致痫过程中是否也通过促进星形胶质细胞细胞(Ast)的增殖及功能而参与致痫活动,本实验用体外细胞培养及流式细胞分析技术来检测IL-1β和IL-6对Ast细胞周期的影响。采用体外细胞培养方法获得纯化的大鼠大脑皮质星形胶质细胞,分为两组在其培养液中分别加入IL-1β或IL-6,在作用6h、12h及24h后,通过流式细胞仪检测IL-1β、IL-6对Ast细胞周期的影响。结果表明IL-1β、IL-6作用于Ast后,可引起细胞周期的显著变化,表现为G1期细胞数减少,S期、G2/M期细胞数增多,以作用12h时变化最明显。以上结果表明:IL-1β、IL-6可提高Ast细胞周期的进程而促进Ast增殖。此结果提示,在IL-1或IL-6致痫大鼠脑内,有Ast增殖,它们可能和神经元一起共同参与癫痫的发病过程。小结:IL-1β、IL-6能诱发大鼠癫痫发作行为,IL-1ra及糖皮质激素能抑制此作用,上述效应被脑电检测所证实。其致痫活动过程中,一方面,IL-1β、IL-6分别作用于各自的特异性受体,激活脑细胞内的AC-cAMP-PKA信号转导通路,产生一系列级联反应,使细胞内蛋白质磷酸化产生生物学效应;也可通过升高NOS的含量,使NO活性增强,促进脑内Ca2+升高或调节基因转录;这两条信号通路的共同作用,参与了癫痫的发生。另一方面,IL-1β、IL-6通过打破Glu和GABA的代谢平衡或调节二者的基因转录水平,从而升高兴奋性神经递质Glu含量并同时下调抑制性神经递质GABA的含量,使脑神经元兴奋性增强。而Glu、NO含量升高,还可能通过激活NMDA受体,使神经元内Ca2+升高,后者可引起细胞过度去极化产生异常放电。IL-1受体拮抗剂和免疫抑制剂糖皮质激素可拮抗IL-1和IL-6对PKA、NO、Glu、和GABA的影响。此外,IL-1β、IL-6在体外能促进纯化培养的Ast的增殖,后者可能通过与神经元相互作用或形成胶质瘢痕而影响大脑的正常生理调节功能,同样起着促进癫痫发作的作用。综上所述,细胞因子IL-1、IL-6致痫机制是一个极其复杂的过程,可通过激活不同的信号通路介导致痫信号;可引起与癫痫发作有密切关系的Glu和GABA神经递质含量变化,使神经元兴奋性增高;还可通过促Ast的细胞周期进程,使Ast增殖。神经元和神经胶质细胞的作用相互伴随,从而促进癫痫的形成和发作的维持。