卵形鲳鲹生长激素(GH)和催乳素(PRL)基因克隆及原核表达

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生长激素和催乳素来源于同一个祖基因,是鱼类调控生长内分泌的重要因子。本文克隆得到卵形鲳鯵生长激素以及催乳素的ORFcDNA序列,构建生长激素以及催乳素原核表达载体。1.从卵形鲳鯵转录组中得到887bp的生长激素cDNA全长序列。利用RT-P CR方法从卵形鲳鯵下丘脑中克隆获得生长激素ORF cDNA序列,该ORF是由17个信号肽和162个成熟肽组成。卵形鲳鯵生长激素ORF的氨基酸相对分子量为22695.03,理论PI为6.73,为偏酸性氨基酸,其疏水性氨基酸有71个。氨基酸序列比对分析结果表明:卵形鲳鯵与鱼类的氨基酸同源性都在50%以上,其中与鯵科的黄尾鰤氨基酸同源性89.6%为最高。卵形鲳鯵生长激素的ORF氨基酸序列含有两个生长激素家族的标签序列,分别为CnSdyliSPidkheTqrssvlkLlsiscq LveSW和CFKkDMhKVEtYltVakC。卵形鲳鯵生长激素蛋白具有亲水性,其三级结构有4个α-螺旋柱,这与其他鱼类绳子生长激素蛋白结构相似。2.利用卵形鲳鯵转录组获得催乳素1586bp cDNA全长序列,通过RT-PCR方法从该鱼脑垂体中克隆得到催乳素的ORF cDNA序列。该开放阅读框由24个信号肽和185个成熟肽组成多肽的单链。卵形鲳鲹催乳素ORF的氨基酸相对分子量为23178.89,理论PI为8.60,其疏水性氨基酸有68个。氨基酸序列比对分析发现:卵形鲳鯵与其他鱼类催乳素氨基酸序列相似度均在55%以上,而80%以上的只有鲈形目的许氏平鲉、斜带石斑鱼。卵形鲳鯵催乳素ORF氨基酸序列含有催乳素家族的两个标签序列,分别为ChTssLqTPndkaqAlqlseadLmslarsLlq AW和CLRrDShKIDsFlkllrC。卵形鲳鯵催乳素蛋白具备亲水性,其三级结构有4个α-螺旋柱,这与其他鱼类的催乳素蛋白结构相似。卵形鲳鯵生长激素ORF氨基酸序列与其催乳素ORF氨基酸序列的同源性为88%。3.采用pEASY-BluntE1表达载体分别与卵形鲳鯵生长激素和催乳素的ORF cDNA序列构建重组质粒,并用BL21(DE3)感受态细胞转化,使用IPTG诱导蛋白表达,进行SDS-PAGE电泳验证:催乳素诱导组在23KDa位置上下有清晰的蛋白条带,与预测卵形鲳鯵催乳素蛋白相对分子量23.1KDa相一致;卵形鲳鯵生长激素蛋白诱导组在23KDa位置附近有清晰蛋白条带。
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