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播娘蒿(Descurainia sophia L.)属于十字花科一年或越年生杂草,是为害我国麦田的恶性杂草之一。苯磺隆是磺酰脲类除草剂,主要用于防治麦田播娘蒿等阔叶杂草,从1988年在我国登记使用,经过连续多年的使用,播娘蒿已对苯磺隆产生了严重抗药性。本研究以采自北京、河南、河北和山东省份的麦田播娘蒿为研究试材,测定了不同播娘蒿种群对苯磺隆的抗性水平和抗性机理,将具有不同乙酰乳酸合成酶(ALS)突变型播娘蒿种群繁殖、纯化为具有单一突变类型的种群,并以此为研究对象进一步研究了不同ALS突变型对ALS除草剂交互抗性、ALS酶功能和支链氨基酸含量的影响,探讨了利用分子生物学技术鉴定抗性植株的快速检测方法,主要研究结果如下:1.抗苯磺隆播娘蒿种群初步鉴定利用区分剂量法鉴定了 73个播娘蒿种群对苯磺隆的抗性,结果表明:28个为抗性种群,18个种群具有潜在的抗性风险,27个为敏感种群。2.抗性播娘蒿ALS基因突变多样性研究播娘蒿ALS基因突变多样性鉴定结果表明,播娘蒿体内存在两个ALS基因,分别为ALS1和 ALS2,ALS1 基因上 Pro197 突变成 Leu、Ser、Thr、His 或 Tyr,Asp376 突变成 Glu,Trp574突变成Leu,ALS2基因上Pro197突变成Ser或Thr。在28个抗性突变种群中Pro-197-Leu突变比例为 39.3%,Pro-197-Ser 突变比例为 28.6%,Pro-197-Thr 突变比例为 28.6%,Pro-197-His 突变比例为 10.7%,Pro-197-Tyr 突变比例为 3.6%,Asp-376-Glu 突变比例为 3.6%,Trp-574-Leu 突变比例为7.1%,其中Pro-197-Tyr突变在播娘蒿上是首次鉴定并发现。Trp-574-Leu(in ALS1)突变和Pro-197-Thr(in ALS2)突变发生在同一抗性植株中,这是首次发现的在田间自然选择条件下而形成的双突变杂草。3.不同ALS突变型对播娘蒿抗性和交互抗性影响研究为了减少不同种群间遗传背景差异,对具有不同ALS突变型的播娘蒿进行单株繁殖,获得了具有不同突变纯合子的播娘蒿种群,分别为pHB08(Pro-197-Leu)、pHB22(Pro-197-Ser)、pHB23(Pro-197-Thr)、pHB24(Pro-197-His)、pHB25(Asp-376-Glu)和 pHB42(Trp-574-Leu)种群,以及 Trp-574-Leu(in ALS1)突变和 Pro-197-Thr(in ALS2)突变的 pHB30 种群。盆栽法测定了纯化种群 pHB08、pHB22、pHB23、pHB24、pHB25、pHB42 和 pHB30 对苯磺隆的抗性水平,结果表明纯化的播娘蒿对苯磺隆产生了高水平的抗性,其中pHB25(Asp-376-Glu)和 pHB30(Trp-574-Leu + Pro-197-Thr)种群比 pHB08(Pro-197-Leu)、pHB22(Pro-197-Ser)、pHB23(Pro-197-Thr)、pHB24(Pro-197-His)和 pHB42(Trp-574-Leu)种群对苯磺隆的抗性水平更高(789.3-815.0vs 152.3-366.3)。不同ALS突变型播娘蒿对ALS除草剂的交互抗性测定结果表明,Pro-197-Leu、Pro-197-Ser、Pro-197-Thr和Pro-197-His突变的播娘蒿种群对氯吡嘧磺隆(SU)、唑嘧磺草胺(TP)和氟唑磺隆(SCT)产生了交互抗性,对咪唑乙烟酸(IMI)和嘧啶肟草醚(PTB)没有交互抗性;而Asp-376-Glu突变的pHB25种群,Trp-574-Leu突变的pHB42种群和双突变的pHB30种群对氯吡嘧磺隆、唑嘧磺草胺、氟唑磺隆、咪唑乙烟酸和嘧啶肟草醚五类ALS除草剂都产生了交互抗性。4.不同ALS突变型对播娘蒿ALS功能影响研究乙酰乳酸合成酶催化活性和对苯磺隆敏感性测定结果表明,和敏感种群相比,抗性种群pHB08、pHB22、pHB23、pHB24、pHB25和pHB42乙酰乳酸合成酶对苯磺隆的敏感性分别下降了 250.0、205.8、263.7、708.4、2844.7 和 485.3 倍,且 pHB08、pHB22、pHB23 和 pHB24 种群ALS催化活性有显著性降低(11%-21%),pHB25种群ALS催化活性有显著性升高(26%),而pHB42种群ALS催化活性没有显著性差异。酶动力学研究结果表明,和敏感种群相比,抗性种群pHB08、pHB22、pHB23、pHB24、pHB25和pHB42乙酰乳酸合成酶对底物的Km值和最大反应速率Vmax值都有显著性下降,Km值下降了0.63-0.87 倍,Vmax值下降了 0.30-0.91 倍。反馈抑制研究表明,Pro-197-Leu、Pro-197-Ser、Pro-197-Thr和Pro-197-His突变种群乙酰乳酸合成酶对亮氨酸的反馈抑制减弱,对缬氨酸和异亮氨酸的反馈抑制则没有影响,Asp-376-Glu突变种群和Trp-574-Leu突变种群乙酰乳酸合成酶对亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸的反馈抑制都减弱。5.不同ALS突变型对播娘蒿体内支链氨基酸含量影响不同ALS突变型播娘蒿体内支链氨基酸含量测定结果表明,Pro-197-Leu、Pro-197-His、Pro-197-Ser和Pro-197-Thr突变抗性植株体内亮氨酸和异亮氨酸含量和敏感植株没有差异(Pro-197-Ser突变植株体内异亮氨酸含量比敏感植株较低),Asp-376-Glu突变和Trp-574-Leu突变抗性植株体内亮氨酸和缬氨酸含量比敏感植株显著性增加。6.抗苯磺隆播娘蒿快速检测方法研究针对敏感与抗性播娘蒿植株在ALS基因Pro197、Asp376或Trp574位点的碱基差异,用CAPS方法设计BsmFI、MboI和BsrDI酶切检测了 48株播娘蒿植株的靶标抗性,结果表明,此方法准确率为100%,可用于快速检测靶标突变的抗性播娘蒿植株。