肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC,简称肝癌）是人类常见的恶性肿瘤之一,在全球癌症发病率排行榜上列第五位,占所有癌症的5.6%,全球每年新发肝癌约为564000例。肝癌在我国癌症中病死率排第二位,全球50%以上的肝癌发生在我国。近几十年来,全球对肝癌的临床和基础研究都取得了不小的进步。但是就肝癌整体治疗而言,无论在东方还是西方,其5年生存率仍都只有5%左右,5年的肿瘤复发率高达60-70%。肝癌术后的高复发率严重影响了病人的生存时间,因此肝癌复发转移的研究具有重要的临床意义。肝癌的复发转移是一个多环节,多阶段,多基因参与的动态变化过程。从肿瘤细胞在原发部位向外侵袭开始,到瘤细胞在转移复发靶器官定居生长结束,整个过程都受到机体微环境因素,尤其是炎症/免疫因素的影响。作为目前研究热点的肿瘤微环境在肝癌的复发转移中起着不可或缺的作用。肿瘤微环境是由肿瘤细胞和其周围的纤维母细胞、上皮细胞、固有及特异性免疫细胞、肿瘤血管和淋巴管结构的组成细胞、组织特异性的间叶细胞及它们的表达产物、代谢物质等成分构成,是肿瘤发生、发展的局部环境。大量研究表明,作为与肿瘤密不可分的局部微环境,对肿瘤的发生、发展起着不容忽视的作用。更有研究发现肿瘤局部微环境的免疫学因素是超越TNM分期的,目前为止最为准确的独立预后因素,提出“癌症是一种微环境和免疫疾病”这一重要概念,反映了肿瘤微环境在肿瘤研究中日益重要。就原发瘤而言,我所的前期研究已经证实了瘤内的免疫状态的失衡,与肝癌细胞的侵袭潜能及患者的预后密切相关,并在此基础上提出了“免疫微环境分子预测模型”。这一模型的建立,可以较好地预测肝癌患者的复发转移。根据“种子与土壤”学说,转移靶器官的状态是决定转移复发是否发生的重要“限速”因素之一。而肝癌术后的转移复发多发生于术后残余肝脏,即其转移复发靶器官是肝脏本身,故残余肝的微环境,尤其是炎症免疫微环境状态可以直接影响肝癌术后病人的预后。癌旁肝组织可以很好的代表残余肝的状态,前期的研究已经发现癌旁活化肝星状细胞与肝癌复发转移密切相关。因此,我们认为,联合研究癌内和癌旁的炎症免疫微环境状态,是对肝癌转移复发起始和终末阶段的全面分析,应具有更好的预测价值。我们首先研究了癌旁炎症细胞对肝癌预后的影响。肝癌术后的转移复发多发生于术后残余肝脏,即其转移复发靶器官是肝脏本身。故残余肝的微环境,尤其是炎症免疫微环境状态可以直接影响肝癌的预后。研究发现慢性中毒或细胞生长受抑制的肝脏组织微环境能选择性的克隆扩增变异细胞,形成肿瘤病灶。在正常肝脏组织中移植的肝癌细胞不能形成肿瘤病灶,而经过Retrorsine（抑制正常肝细胞生长）预处理的动物肝脏,其移植的癌细胞能顺利存活,并最终形成癌灶。肝炎、肝硬化病人的肝脏细胞中的端粒酶缩短,再生能力大大低于正常肝组织,易形成结节,是肝癌的危险因素。因此我们认为肝癌术后复发是由于术后残余肝脏选择性地扩增播散的瘤细胞,形成复发灶,或者是选择性地扩增新变异的细胞,形成新的肝癌病灶。众多研究也证实肝硬化是肝癌术后复发的独立风险因素。肝癌术后参残余肝脏的炎症状态和它的再生能力成负相关,炎症反应越重,其再生能力越差,就越容易形成肿瘤复发病灶。慢性炎症和癌症之间的临床联系已被大规模的流行病学调查所证实,约有15%的人类肿瘤发现和慢性炎症相关,肝癌就是其中的典型代表。反应肝脏炎症状态的临床指标如ALT、γ-GT等已被证实与肝癌的复发成正相关,表明肝脏的炎症状态与肝癌的复发密切相关。肿瘤微环境中的炎症细胞已被证实广泛地参与肿瘤的血管生成,免疫杀伤,免疫逃逸,侵袭转移等多个环节,而对癌旁组织微环境中的炎症细胞的研究则相对较少。癌旁的肝组织可以很好的代表残余肝的状态,因此我们以癌旁肝组织内的炎症细胞为对象,研究残余肝脏的炎症状态对肝癌预后,特别是肝癌复发转移的影响巨噬细胞和肥大细胞是固有免疫系统的重要组成细胞,广泛参与机体的炎症反应。近来研究发现,它们和肿瘤的发生、发展密切相关。肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associatedmacrophage,TAM）是经过特定肿瘤微环境驯化的一种特殊类型的巨噬细胞,表现为分化相关抗原、羧肽酶M、CD51、TNF-α的低表达和IL-1、IL-6的高表达。已有的研究证实TAM在不同的肿瘤中对肿瘤的预后有双向作用:它既可以在细胞增殖、基质调控和血管生成等环节促进肿瘤的发生、发展（2型巨噬细胞的功能）,同时作为多功能免疫细胞,它又能直接杀死肿瘤细胞,参与固有免疫反应,还可以通过抗原递呈激活过继免疫反应而发挥抗肿瘤效应（1型巨噬细胞的功能）。研究发现在乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌等肿瘤中TAM主要倾向于促进肿瘤的发展,而在胃癌、肺癌、结直肠癌等则发现其有助于改善预后。肝癌中的TAM与预后的关系也有争议,不同的研究者得出相反的结果,且对于瘤旁微环境中的巨噬细胞与肿瘤关系的研究较少。同样,肥大细胞（mast cell,MC）在肿瘤的发生、发展过程中也有自己独特的作用。目前研究认为肥细胞主要通过三个方面促进肿瘤的发展:一是促进肿瘤血管生成;二是抑制肿瘤局部的免疫反应和对肿瘤的免疫监视,诱导肿瘤免疫耐受和免疫逃逸;三是协助肿瘤细胞破环基质,促进肿瘤的侵袭转移。此外研究也发现肥大细胞在乳腺癌和卵巢癌与预后成正相关。进一步研究发现肥大细胞内有多种抑癌和促癌的细胞因子,不同状态下能选择性地释放不同的介质,因而对肿瘤具有双向作用。已有研究表明巨噬细胞和肥大细胞通过分泌各种介质或直接接触,在炎症反应和肿瘤演进过程中具有协同作用。我们认为肥大细胞和巨噬细胞是肝脏炎症反应的主要参与者,又参与调节炎症反应,且与肿瘤的发生、发展及侵袭转移密切相关,因此我们以巨噬细胞和肥大细胞为癌旁炎症细胞代表,研究肝癌瘤旁微环境的炎症状态对肝癌预后的影响,特别是对肝癌术后复发转移的影响。随后,我们针对我所前期利用免疫效应/过继免疫相关基因（GNLY、GZMB、TRAV10、CD3Z、TBX21、IFNG、GATA3、IRF1）建立的“免疫微环境分子预测模型”进行了验证。“免疫微环境分子预测模型”综合了固有免疫和特异性免疫,并发现了模型中某些基因表达（GATA3和IRF1）是肿瘤细胞和免疫细胞所共有的,也就是说全面地囊括了肿瘤微环境中的肿瘤细胞本身和免疫因素,具有强有力的预测效能。“免疫微环境分子预测模型”的建立也符合“肿瘤转移决定于肿瘤细胞、肿瘤微环境和宿主遗传背景三方面综合因素”这一理论。我们在随机选取的298名患者中验证了“免疫微环境分子预测模型”的有效性、稳定性和通用性。最后,我们将“免疫微环境分子预测模型”和癌旁炎症细胞联合分析,作为肝癌术后复发转移的预测指标。肝癌的原发肿瘤,肿瘤微环境,瘤旁微环境在肝癌的不同阶段有不同的主次作用。早期未形成肿瘤阶段,主要是肝脏的组织微环境在肝癌病灶形成过程中占主导地位。在肿瘤形成后,其发生发展过程是以原发肿瘤和肿瘤微环境的作用为主导。肿瘤细胞和肿瘤微环境相互作用,通过肿瘤血管生成,免疫逃逸,基质调控,免疫杀伤等机制,促进或抑制肿瘤的发展和向外侵袭能力。接下来,播散的肝癌细胞在肝脏上重新定植,生长,形成转移灶过程,则主要是由肝脏的组织微环境,即肝癌的瘤旁微环境,起主导作用。肝癌术后残余肝的炎症状态和肝硬化抑制了正常肝细胞的再生能力,导致残余肝脏选择性地克隆增殖转移的肝癌细胞活扩增新的变异细胞形成肝癌病灶。在第二部分验证过程中,我们发现在模型预测复发低危组的部分病人很快就复发转移了,而部分高危组的病人却未观察到复发情况。鉴于模型只涵盖了肿瘤微环境中免疫效应/过继免疫相关基因,对在术后起主导作用的癌旁组织微环境却未涉及。因此我们联合癌旁微环境中的炎症细胞分析这一现象,发现在低危复发组的病人中癌旁的炎症细胞浸润显著增多,而高危未复发的病人其癌旁炎症细胞则相对较少。而第一部分研究显示肝癌癌旁炎症细胞表现为促癌作用,这就很好的解释了产生这一现象的原因。我所前期建立的“免疫微环境分子预测模型”反映了肝癌在原发病灶生长,向外扩散阶段中起主要作用的肿瘤免疫微环境,残余肝脏的炎症状态则是播散的肝癌细胞重新在肝脏形成转移复发灶的主要影响因素,而肝癌瘤旁微环境能够很好的代表术后残余肝脏的状态。因此,我们将“免疫微环境分子预测模型”和瘤旁微环境进行联合分析,覆盖了肝癌复发转移的全过程,具有更大的预测价值。第一部分癌旁炎症细胞与肝癌预后的关系本研究旨在探索肝癌癌旁组织中巨噬细胞和肥大细胞的分布情况,是否相关,并分析两者与临床病理特征的关系及对肝癌预后的影响。我们随机选取了298例肝癌患者,获得他们的肿瘤石蜡标本,应用组织芯片技术和免疫组织化学方法测定癌旁巨噬细胞和肥大细胞的分布情况,并做相关分析及生存分析。结果显示:（1）癌旁巨噬细胞和肥大细胞两者正相关（R=0.442,P<0.001）。（2）癌旁巨噬细胞、肥大细胞与各项临床病理特征比较,发现癌旁的肥大细胞在高γ-GT（P=0.001）,肿瘤直径>5cm（P=0.04）,有癌栓（P=0.019）和BCLC:B-C期（P=0.007）的病人中数量明显高于低γ-GT,低ALT,肿瘤直径≤5cm,无癌栓和BCLC:O-A期的病人。而癌旁的巨噬细胞只在有癌栓的病人中明显高于无癌栓的病人（P=0.024）（3）单因素COX分析显示癌旁的巨噬细胞（P=0.003,P=0.027）,肥大细胞（P=0.004,P=0.001）,以及MC&Mφ联合（P=0.001,P=0.001）与肝癌的总体生存率和无瘤生存率呈显著负相关。此外癌栓阴性（P<0.001）,包膜完整（P=0.008）,分化较好（P=0.001）,无肝硬化（P=0.005）,BCLC分期O-A（P<0.001）,术前AFP（P=0.001）、γ-GT（P<0.001）正常,肿瘤较小,≤5cm（P<0.001）,HBeAg阴性（P=0.021）,肿瘤单发（P=0.028）的病人,其总体生存率较好。癌栓阴性（P<0.001）,包膜完整（P<0.001）,分化较好（P=0.027）,无肝硬化（P=0.049）,BCLC分期O-A（P<0.001）,术前AFP（P=0.001）、γ-GT（P=0.036）正常,肿瘤较小（P<0.001）,患者的无瘤生存率相对较高。（4）将癌旁肥大细胞和巨噬细胞进行联合分组:Ⅰ:MC高&Mφ高;Ⅱ:两者一高一低;Ⅲ:MC低&Mφ低。各组之间进行Kaplan-Meirer生存分析,结果显示癌旁肥大细胞和巨噬细胞都高时,其总体生存率（P=0.001）和无瘤生存率（P<0.001）都相对较低。两者都低时其总体生存率（P=0.005）和无瘤生存率（P=0.016）较好。（5）多因素COX分析显示癌旁巨噬细胞计数与患者的总体生存率显著负相关（P=0.003）,癌旁肥大细胞是患者无瘤生存率的独立预测指标（P=0.002）。而癌旁肥大细胞和巨噬细胞的联合分组是患者总体生存率（P=0.004）和无瘤生存率（P=0.048）的一个独立预测指标。此外肿瘤的BCLC分期也是患者总体生存率（P=0.009）和无瘤生存率（P=0.004）的独立预测指标。（6）ROC曲线分析:对于总体生存率,MC&Mφ联合(AUC_os=0.608,P=0.001)仅次于术前γ-GT(AUC_os=0.646,P<0.001),高于BCLC分期(AUC_os=0.606,P=0.002),其余指标为MC(AUC_os=0.586,P=0.011),Mφ(AUC_os=0.573,P=0.031),肿瘤分化(AUC_os=0.600,P=0.003),此外肝硬化的P值>0.05,无意义;对于无瘤生存率,MC&Mφ联合(AUC_recurrence=0.594,P=0.005)仅次于BCLC分期(AUC_recurrence=0.616,P=0.001),其余指标为MC(AUC_recurrence=0.592,P=0.006),包膜(AUC_recurrence=0.588,P=0.009),术前AFP(AUC_recurrence=0.574,P=0.027),此外Mφ的P值无意义以上结果表明,作为固有免疫反应的重要组成细胞,巨噬细胞和肥大细胞反应了肝癌瘤旁微环境的炎症状态。局部的炎症反应越强,越有利于肿瘤的生长侵袭和复发转移。因此进一步探索肿瘤癌旁微环境中的炎症反应与肿瘤侵袭转移的关系可以为临床上预防肝癌转移复发提供理论指导。第二部分“免疫微环境分子预测模型”的再验证本研究是对我所前期利用免疫效应/过继免疫相关基因（GNLY、GZMB、TRAV10、CD3Z、TBX21、IFNG、GATA3、IRF1）建立的“免疫微环境分子预测模型”进行大样本的验证,探讨模型在预测肝癌病人复发转移的有效性、稳定性和通用性。我所前期筛选了27个免疫效益/过继免疫、免疫抑制和炎症相关的代表性的基因,借助于PCR微阵列芯片检测了随机选取的122例肝癌患者手术切除冰冻保存的肿瘤标本中上述基因的表达情况,通过Cluster和Treeview软件对基因表达进行了回顾性的非监督聚类分析（Unsupervised Hierarchical Cluster）和相关性矩阵分析（Correlation Matrix）,及聚类结果的生存分析,并进一步利用国际上通用的复发评分系统（Recurrence Score）建立了以癌内免疫效应/过继免疫相关基因（GNLY、GZMB、TRAV10、CD3Z、TBX21、IFNG、GATA3、IRF1）为主的“免疫微环境分子预测模型”。模型公式为:rs8=（-3.108×IFNG value）+（-3.534×TBX21 value）+（-2.975×GATA3 value）+（-4.361×GZMBvalue）+（-5.530×IRF1 value）+（-3.497×GNLYvalue）+（-3.154×CD3Z value）+（-3.932×TRAV10 value）rs8值越高,表明患者复发转移的风险越大。该模型反映了肝癌癌内免疫效应/过继免疫微环境在肝癌复发转移过程中的作用,具有较高的肝癌复发转移的预测能力。我们前期已经在第一部分研究随机选取的298例肝癌标本中检测了8个模型应用的癌内免疫效应/过继免疫相关基因（GNLY、GZMB、TRAV10、CD3Z、TBX21、IFNG、GATA3、IRF1）的表达情况,根据模型公式计算出每个病人的rs8评分值。利用前期研究规定的cutoff值将患者分为复发转移高危和低危两组,通过生存分析和ROC曲线验证“免疫微环境分子预测模型”的稳定性、有效性和通用性。结果显示:（1）以模型建立时选定的cutoff值进行分组根据rs8评分值将患者分成高危和低危两组。单因素COX生存分析发现模型与肝癌的总体生存率（P<0.001）和无瘤生存率（P<0.001）显著负相关。多因素分析显示模型是肝癌总体生存率（P<0.001）和无瘤生存率（P<0.001）的一个独立预后指标。（2）ROC曲线分析将多因素分析有意义的指标（包膜,术前AFP,BCLC分期,模型）进行复发转移的ROC曲线分析,结果显示模型分组(AUC_recurrence=0.620,P<0.001),BCLC分期(AUC_recurrence=0.616,P=0.001),包膜(AUC_recurrence=0.588,P=0.009),术前AFP(AUC_recurrence=0.574,P=0.027)。以上结果表明,“免疫微环境分子预测模型”能较好的预测肝癌的复发转移,其预测效能甚至优于BCLC分期等临床指标。并且具有较高的稳定性和通用性,有临床应用价值。第三部分癌旁炎症细胞与“免疫微环境分子预测模型”的关系本研究是通过研究“免疫微环境分子预测模型”,分析癌旁炎症细胞在该模型预测患者复发转移风险与实际病人复发转移各组间的差异,探讨癌旁炎症细胞联合“免疫微环境分子预测模型”进一步提高肝癌复发转移预测价值的可能。我们在第二部分模型验证过程中,发现有部分高危组病人未观察到复发现象,而低危组有部分病人却很快就复发了。面对这一现象,我们分析发现“免疫微环境分子预测模型”是根据肿瘤微环境的免疫效应/过继免疫基因建立的,它不能反映瘤旁微环境的功能,也缺乏对炎症状态的关联,而近来研究表明癌旁的炎症状态在肝癌复发转移中有重要作用,因此我们联合第一部分研究,从瘤旁微环境的炎症状态来分析产生这种困惑的原因。我们根据患者的模型rs8值和实际复发情况将298例患者分成4个组:Ⅰ=低危复发组;Ⅱ=低危未复发组;Ⅲ=高危复发组;Ⅳ=高危未复发组。比较各组之间癌旁炎症细胞Mφ和MC的差异,然后联合癌旁炎症细胞和“免疫微环境分子预测模型”进行ROC曲线分析。结果:1)以所有复发病人为研究对象用x²检验比较癌旁巨噬细胞和肥大细胞在各组之间的差异,结果显示:巨噬细胞在低危复发组明显高于高危未复发组（P=0.04）,而肥大细胞在低危复发组也显著高于高危未复发组（P<0.001）,在高危未复发组则明显低于高危复发组（P=0.007）,在低危复发组高于低危未复发组（P=0.006）,同时在低危复发组明显高于高危复发组（P=0.046）,而在高危未复发组则低于低危未复发组（P=0.044）。2)以早期复发的病人为研究对象（1）以2年内复发的病人为研究对象结果显示:癌旁的巨噬细胞在低危复发组明显高于高危未复发组（P=0.024）,而肥大细胞在低危复发组明显高于低危未复发组（P=0.002）,在低危复发组高于高危未复发组（P<0.001）,在高危未复发组显著低于高危复发组（P=0.008）。（2）以1年内复发的病人为研究对象结果显示:癌旁巨噬细胞在低危复发组较高危未复发组为高（P=0.03）,在高危未复发组较高危复发组为低（P=0.032）。而肥大细胞同样在低危复发组较高危未复发组为高（P<0.001）,在低危复发组高于低危未复发组（P=0.008）,高危未复发组较高危复发组为低（P=0.004）。3)ROC曲线分析结果显示:以rs8联合癌旁肥大细胞的AUC为最大(AUC_recurrence=0.666,P<0.001),其余的AUC值分别为:rs8联合Mφ(AUC_recurrence=0.634,P<0.001),rs8(AUC_recurrence=0.620,P<0.001),癌旁MC联合Mφ(AUC_recurrence=0.594,P=0.005),癌旁MC(AUC_recurrence=0.592,P=0.006),BCLC分期(AUC_recurrence=0.616,P=0.001),包膜(AUC_recurrence=0.588,P=0.009)。以上结果表明,我所建立的“免疫微环境分子预测模型”根据rs8值的大小预测肝癌复发转移风险,虽然有较高的预测价值,但是如果同时考虑癌旁的炎症状态,可以进一步提高其预测的效能。结论（1）癌旁的巨噬细胞与肝癌患者的总体生存率负相关,而肥大细胞则促进肝癌的复发转移,两者在促进肿瘤进展时具有协同作用。癌旁巨噬细胞和肥大细胞的联合分析是预测肝癌患者预后的一个独立指标。（2）我所前期建立的“免疫微环境分子预测模型”对肝癌复发转移有较好的预测价值。并且具有较高的稳定性和通用性,有临床应用价值。（3）在验证过程中出现的低危病人较快复发,高危病人未观察到复发的现象,我们分析发现:较快复发的低危病人癌旁炎症细胞浸润多,而未观察到复发的高危病人癌旁炎症细胞浸润少,癌旁炎症细胞能促进肝癌的复发转移,是导致这一现象产生的原因。（4）对肝癌术后复发转移的预测,癌旁肥大细胞和“免疫微环境分子预测模型”联合分析比单独的模型和模型与癌旁巨噬细胞联合分析,有更高的预测效能。创新点（1）首次从炎症角度大样本的证实癌旁肥大细胞和巨噬细胞能够促进肝癌的复发转移,且两者有协同作用。（2）联合分析肿瘤微环境和肿瘤转移靶器官微环境是一种有效的预测肝癌复发转移的方法。临床应用前景癌旁的炎症反应有促进肝癌侵袭转移的作用,为临床预防肝癌复发转移提供新的途径。分析癌旁的炎症状态,联合“免疫微环境分子预测模型”,可以更好地预测肝癌术后病人的复发转移并指导个体化治疗的实施。