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丙型肝炎病毒是于1989年被发现的正链RNA病毒,严重威胁着人类健康。WHO报道全球约有1.7亿人被感染,我国有近4000万的人被感染。HCV的基础研究及药物筛选一直很难全面展开,主要因为是缺乏体外培养系统。2005年,日本的Wakita实验室从1例罕见的暴发性丙型肝炎病人体内分离出JFH1毒株(HCV2a型),可以在肝癌细胞系Huh7中复制感染,但是其产生的病毒滴度比较低,严重制约了其在HCV基础及临床研究中的应用。
本研究中,通过在Huh7细胞中连续2年传代培养JFH1,我们获得了复制能力比JFH1高103倍的JFH1a(adapted JFH1)病毒群,研究表明JFH1a对IFN-α的处理的敏感性与JFH1wt(wild type JFH1)相同。根据Genbank(No.AB047639)上发表的JFH1序列,我们设计了两对重叠引物,用于扩增JFH1a的cDNA全长序列,分子克隆和序列分析表明,JFH1a主要由两种典型性的突变病毒A和B组成。通过基因重组的方法,将A或B的5’片段(即5'UTR,Core,E1,E2,NS2,部分的NS3)置换到JFH1wt基因组中,我们构建了两株突变株病毒JFH1-A/WT(A/WT)和JFH1-B/WT(B/WT)。通过体外转录获得的RNA,转染Huh7.5.1细胞,得到了A/WT和B/WT的感染性病毒。比较结果显示,转染细胞产生的A/WT和BANT的病毒滴度(titer)是JFH1wt的102-103倍；B/WT的传染力(specific infectitivity)是JFH1wt的10倍,而A/WT的传染力与JFH1wt相似；B/WT在Huh7.5.1细胞中的扩散非常快且形成较大的病毒噬斑,感染曲线上升迅速,这些与JFH1a的特性类似；A/WT扩散也比JFH1wt快但曲线缓慢上升,形成的噬斑大小与JFH1wt相似。证明B/WI是一株很有效的在细胞中培养的HCV病毒株。
鉴于B/WT的高效的复制和感染特性,我们进一步研究了各个氨基酸突变对复制及感染的影响。通过氨基酸突变的方法,将6个氨基酸突变(V31A,K74T,G451R,V756A,V786A,Q862R)分别逐一的更换到JFH1wt基因组或从B/WT基因组突变回JFH1wt,我们构建了12株突变病毒株,VVT系列(31+,74+,451+,756+,786+,862+)和B/WT系列(31-,74-,451-,756-,786-,862-)。比较发现,氨基酸G451R突变不仅提高了JFH1wt约10倍的病毒滴度,而且明显促进了传染力,突变体病毒451+的传染力几乎与病毒B/WT感染性相同；而突变K74T和Q862R则只提高了约10倍的病毒滴度。突变病毒感染na(i)ve Huh7.5.1细胞的感染曲线表明,K74T,G451R和Q862R滴度是JFH1wt的10倍。传染力的提高主要取决于G451R的作用,但是病毒滴度和在细胞中扩散能力的增强,是由各个氨基酸特别是K74T,G451R和Q862R共同相互作用的结果。
目前定量HCV的经典方法有三种:ELISA,FFU,qRT-PCR。但是这些方法耗时,耗力,且不经济。我们利用JFH1的突变体A/WT和B/WT的高效复制的特性,在其基因组NS5A区插入Renilla荧光素酶基因,构建了ANMT-Rluc和B/WT-Rluc两个突变病毒株。试验结果证明,FFU检测系统与荧光素酶检测系统存在线性关系。表明通过检测荧光素酶蛋白的表达量可以间接的测量HCV的量。与JFH1相比,A/WT-Rluc和B/WT-Rluc依然保持着对IFN-α处理的敏感性。A/WT-Rluc和B/WT-Rluc在抗HCV新药物筛选领域将发挥重要作用。