功能性蛋白的高效、高活性重组表达在蛋白质医药以及生物化学研究领域中占据十分重要的地位。但是每一个功能性蛋白都具有特异性,没有一个普遍适用的策略来获得高效、高活性表达的重组蛋白,因此有必要开发不同的策略去表达不同的功能性蛋白。本论文选取了两个比较有代表性的难以表达的功能性蛋白,即动物体系来源的蛇毒类凝血酶和植物体系来源的叶绿素结合蛋白来探索功能性蛋白的高效高活性表达策略。蛇毒类凝血酶是临床治疗血栓病的国家基本药物,由于蛇毒资源有限,天然酶生产面临严峻的挑战,所以利用基因工程手段获得重组蛇毒类凝血酶是满足需求的有效途径。但目前表达量和活性都难以满足大规模制备的要求,是该领域的难点。叶绿素结合蛋白Pcb（prochlorophyte chlorophyll a/b binding protein）结合不同的叶绿素能使光合生物在不同的光照及营养环境下利用光能。深海单细胞蓝细菌Acaryochloris marina以Chlorophyll（Chl）d为主要的捕光色素能利用一般光合物质（Chlorophyll a,b,c）不能利用的远红外光（690～750 nm）,从而适应阴暗的生存环境。而几乎所有的有氧生物,从蓝细菌到植物都以Chi a为主要的色素。在蓝细菌Acaryochloris marina中,Chl d几乎完全替代Chi a行使功能。将结合Chl d的捕光蛋白PcbA转入只含Chl a的蓝细菌,不仅能揭示叶绿素的替代机制,而且也将提供一个系统来探讨光合生物中各种不同捕光策略的功能及其进化机制。本论文主要研究蛇毒类凝血酶和叶绿素结合蛋白这两个功能性蛋白的高活性表达。（一）蛇毒类凝血酶的表达及功能鉴定大连蛇岛蝮蛇蛇毒类凝血酶在大肠杆菌表达系统中以非融合及融合形式进行表达时,并未获得高效、高活性的重组表达。相比于大肠杆菌,甲醇酵母表达系统由于具有表达量高、本身遗传稳定、具翻译后加工能力等优势,在基因工程领域中得到日益广泛的应用。但是前期工作表明,以非融合形式在甲醇酵母表达系统中表达大连蛇岛蝮蛇蛇毒类凝血酶时不能获得理想的表达量。本研究工作从融合的表达策略来研究大连蛇岛蝮蛇蛇毒类凝血酶在毕赤酵母中的高效、高活性重组表达。热休克蛋白（Heat Shock Protein70）是分子伴侣,具有帮助蛋白质正确折叠的功能,已在毕赤酵母中获得高活性高水平的表达（120mg／L）。因此通过将热休克蛋白（Hsp70）与蛇毒类凝血酶的N端融合表达来提高类凝血酶的高效、高活性表达水平。1)毕赤酵母表达重组大连蛇岛蝮蛇蛇毒类凝血酶以Hsp70作为融合标签构建了pPIC9K-hsp70/tle表达质粒,转化毕赤酵母GS115菌株。通过SDS-PAGE分析和Western blot（抗蝮蛇血清做为一抗）证实重组蛇毒类凝血酶获得表达。最佳表达条件为pH 6.0,诱导时间为36小时,甲醇诱导表达浓度为1%,培养基为营养丰富的复合培养基。2)重组蛇毒类凝血酶的分离纯化采用Q Sepharose HP阴离子交换层析、Superdex 200凝胶过滤层析2步层析方法,从培养上清中分离纯化获得,产量为44.5 mg／L,较以前报导的在毕赤酵母中以非融合形式表达的重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶的表达量（10 mg／L）提高了近五倍。活力回收率为67.5%。比活力为33.70 U／mg。纯化后的重组蛇岛蝮蛇类凝血酶经SDS-PAGE分析为单一条带,其表观分子量98 kDa。3)重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶的酰胺水解活性①以人工合成三肽Nα-p-tosyl-Gly-Pro-Arg-p-nitroanilide为底物,重组蛇毒类凝血酶的酶活性最适温度为50℃,最适pH为7.5；②抑制剂的影响：丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF（5 mM）和TLCK（10 mM）分别抑制了重组酶93%和36%的酰胺水解活力,表明重组蛇毒类凝血酶属于丝氨酸蛋白酶家族。抑制剂苯脒只抑制了57%酶活力。EDTA不影响酰胺水解活力,表明大连蛇岛蝮蛇类凝血酶不是金属蛋白水解酶。4)重组大连蛇岛蝮蛇类凝血酶对纤维蛋白原的凝结及裂解活性①重组蛇毒类凝血酶纤维蛋白原凝结活性为499.8 U／mg；②重组蛇毒类凝血酶对纤维蛋白原的裂解方式为：优先裂解Aa-链,然后裂解Bp-链,但不裂解γ-链。（二）叶绿素结合蛋白PcbA的表达及生理活性蓝藻Synechocystis sp. PCC 6803是仅含有Chl a,并且利用藻胆体为捕光天线的蓝细菌,也是基因工程方法制备藻类蛋白的常用工程菌。表达载体pWS19K是通过psbAⅢ的上下游序列将目的基因序列同源重组入蓝藻Synechocystis sp. PCC 6803的基因组中。psbAⅢ与psbAⅡ是蓝藻Synechocystis sp. PCC 6803光合系统Ⅱ中D1蛋白的编码基因,替换任何一个编码基因都不会影响蓝藻的生理活性,因此psbAⅢ替换为pcbA（编码蛋白PcbA）的基因序列不会影响Synechocystis sp. PCC 6803中光合系统Ⅱ的光合性质。表达的重组PcbA可以定位于类囊体膜中并与光合系统Ⅱ结合。利用此重组系统不仅可以研究Ch1 a与PcbA的结合机制,而且也可以研究光合作用生物不同捕光策略的调剂机制及进化发展。1)重组叶绿素结合蛋白PcbA的表达将pcbA基因的3’端加入6xHis-tag构建入pWS19K质粒载体中,转化Synechocystis sp.PCC6803。PCR反应证实pcbA基因已经插入到菌株中psbAⅢ基因位点。SDS-PAGE和western blot方法（anti His-tag做为一抗）证实pcbA因获得了表达,分子量38 kDa左右与预测的理论分子量相符。2)重组叶绿素结合蛋白PcbA的生理活性①重组叶绿素结合蛋白PcbA在宿主中的定位及结合性质通过去垢剂n-dodecyl-β-D-maltoside提取转化菌株的类囊体膜进行SDS-PAGE及western blot证实重组PcbA位于类囊体膜。类囊体膜含有光合系统（PS）Ⅰ/Ⅱ, Blue-Native电泳可以将其分离,并分离的PSⅠ/PSⅡ进行western blot（anti His-tag, anti D1分别做为一抗）分析显示重组PcbA与PSⅡ结合,二维电泳及蛋白印迹杂交（anti His-tag, anti D1分别做为一抗）也显示了相同的结合性质。②重组叶绿素结合蛋白PcbA的生理活性野生型及重组菌株进行全波长扫描分析表明,重组菌株中的藻胆体减少大约40%而类胡萝卜素的含量升高20%。野生型菌株中是以藻胆体为捕光系统,重组菌株中藻胆体含量升高说明重组PcbA的转入对重组菌株的捕光策略产生影响。PcbA的稳定存在需要叶绿素及类胡萝卜素的结合,重组菌株合成更多的类胡萝卜素可能是用来满足重组PcbA稳定的需要。野生型及重组菌株进行荧光光谱分析：1,选择在435 nm下激发得到荧光发射波谱,室温下重组菌株与野生型相比存在一个额外的～705 nm处的肩峰。77K下,重组菌株与野生型相比存在一个额外的～720nm的肩峰,说明转化的PcbA与Chl a结合改变了宿主中Chl a的光学环境使其发生红移。2,选择在685 nm与720 nm下发射得到荧光激发波谱。室温及77K下,在重组菌株中几乎观测不到藻胆体的激发峰值。这提供了直接证据,说明重组PcbA的转入已经改变了菌体的捕光策略,即藻胆蛋白下调,而膜结合天线系统上调。综上,通过不同的表达策略,即热休克蛋白做为融合部分在毕赤酵母中表达Gloshedobin及synechocysits sp. PCC6803做为表达宿主表达叶绿素结合蛋白,获得了功能性蛋白的高水平、高活性表达。这也证实基于宿主基因组DNA构建的表达载体来表达功能性蛋白是一个获得功能性蛋白的高水平、高活性表达的比较好的策略。