苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）是一种重要的昆虫病原细菌,在形成芽胞的同时产生杀虫晶体蛋白（ICPs）。Bt制剂具备靶标特异性强、环境友好等特点,已发展成为目前世界上产量最大、使用面积最广的农林业微生物杀虫剂。但是Bt制剂存在一些不足,如杀虫效果较慢,毒力有限,昆虫易产生抗性等,需不断选育新的Bt菌株或在现有菌株的基础上进行遗传改造,获得高毒力、性状优良的Bt菌株具有重要的理论意义和生产实用价值。选取本实验室从土壤中分离筛选的Bt D18作为出发菌株,利用常压室温等离子体技术（atmospheric and room temperature plasma,ARTP）结合亚硝基胍（NTG）复合诱变选育对小菜蛾高毒的Bt突变株。确定ARTP诱变过程最佳的处理时间是30 s～60 s,选取50 s作为后续诱变的处理时间,利用斜面固体培养镜检初筛,从四轮ARTP递推式诱变及一轮ARTP-NTG复合诱变分离出的956株突变株筛选到197株进行毒力复筛实验,发现平均每轮诱变正突变率可达20%以上,平均逐轮校正死亡率提高幅度约20%左右,最终通过ICPs产量及毒力LC50验证得到两株性状稳定的正突变株AN-L5-1和AN-L5-7,与出发菌株D18相比,ICPs产量分别提高了80.47%、88.31%,对小菜蛾的杀虫毒力均明显提高。同时本研究选取高毒力Bt 4.0718作为出发菌株,利用基因敲除技术分别对mmsB基因、cysC基因的生物学功能进行了研究。mmsB基因编码的3-羟基异丁酸脱氢酶（3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase,Hibadh）是缬氨酸代谢过程中的必需酶。在温敏型载体p Rec-Mob-Ts的基础上构建同源重组敲除质粒,采用接合转移技术将重组质粒转入受体菌Bt 4.0718,成功获得mmsB基因敲除菌株Bt-ΔmmsB,并成功构建mmsB基因回复突变株。结果显示:与原始菌相比,Bt-ΔmmsB稳定期缩短,提前进入衰亡期,芽胞与晶体形成、母细胞裂解时间均提前,晶体蛋白产量和对棉铃虫的杀虫毒力与原始菌株相当;回补菌表型部分恢复。同时在大肠杆菌中成功表达Hibadh蛋白,以期寻找该蛋白的作用靶标,进一步揭示mmsB基因在调控芽胞和晶体蛋白形成中的关键作用。cysC基因编码的腺苷5’-磷酸硫酸激酶（adenosine5’-phosphosulfate kinase,APSK）是半胱氨酸生物合成途径的一个关键酶。采用相同的敲除体系成功获得cysC基因敲除菌株Bt-ΔcysC,成功构建cysC基因回复突变株。结果显示:与原始菌相比,Bt-ΔcysC能正常形成芽胞,但不能形成晶体,晶体蛋白产量和对棉铃虫的杀虫毒力显著减弱;回补菌株表型部分恢复。同时在大肠杆菌中成功表达APSK蛋白。为寻找杀虫晶体蛋白形成的关键调控因子提供了新的理论依据。综上所述,本文采用ARTP诱变技术选育Bt高毒力杀虫菌株,获得两株对小菜蛾杀虫活性明显增强的正突变株。同时对Bt 4.0718中mmsB、cysC两个功能基因进行敲除,获得的工程菌Bt-ΔmmsB杀虫毒力与原始菌相当,但是晶体形成、母细胞裂解时间大幅度提前,使发酵周期缩短,降低了能耗和生产成本,这一表型有望在生产中开发和利用。获得的工程菌Bt-ΔcysC晶体蛋白产量和对棉铃虫的杀虫毒力显著降低,说明cysC是影响ICPs形成的关键功能基因,为研究Bt杀虫晶体蛋白生物合成的代谢调控、构建高毒力的杀虫菌株奠定了理论基础。