【摘 要】
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目的:设计合成一种具有安全性、主动靶向性、pH敏感性的多功能纳米聚合物,用于高效递送CRISPR/Cas9质粒进入肿瘤细胞,发挥基因编辑作用,下调甲基转移酶样3（Methyltransferase-Like3,METTL3）蛋白表达,抑制肝癌细胞增殖,发挥肝癌治疗作用。并进一步探究RNA的m6A修饰表观遗传学在肿瘤增殖发展方面的作用。方法:（1）利用酰胺化反应合成多功能纳米聚合物（sPEG-LPD
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目的:设计合成一种具有安全性、主动靶向性、pH敏感性的多功能纳米聚合物,用于高效递送CRISPR/Cas9质粒进入肿瘤细胞,发挥基因编辑作用,下调甲基转移酶样3（Methyltransferase-Like3,METTL3）蛋白表达,抑制肝癌细胞增殖,发挥肝癌治疗作用。并进一步探究RNA的m6A修饰表观遗传学在肿瘤增殖发展方面的作用。方法:（1）利用酰胺化反应合成多功能纳米聚合物（sPEG-LPD）,并用核磁和红外对其结构进行表征;探头超声制备空白纳米粒（Nanoparticles,NPs）,并考察空白纳米粒的粒径、电位、形态、pH敏感性、血清稳定性、蛋白吸附、细胞毒性、溶血现象等性质参数;琼脂糖凝胶电泳考察纳米载体对CRISPR/Cas9质粒的包载能力并筛选出最佳吸附比,透射电镜观察载基因纳米粒的形态。（2）使用荧光探针标记纳米粒,共聚焦显微镜观察载基因纳米粒的细胞摄取和溶酶体逃逸情况,流式细胞仪定量考察细胞摄取情况:以增强绿色荧光蛋白基因为报告基因,测定纳米粒的转染效率。给药后,T7EI实验考察基因编辑效率,蛋白印迹法（Western blot,WB）考察METTL3蛋白表达水平,Annexin V-FITC/PI分析细胞凋亡情况。（3）构建裸鼠HepG2细胞皮下瘤模型,小动物活体成像和肿瘤组织冰冻切片考察纳米粒的体内靶向性。（4）给药后,评价载基因纳米粒的治疗效果;取肿瘤组织进行切片或提取总蛋白,采用TUNEL染色法,苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-eosinstaining,H＆E）,Western blot和免疫组织化学法（Immunohistochemistry,IHC）考察肿瘤组织的细胞凋亡、组织损伤情况和相关蛋白表达情况。结果:（1）核磁和红外结果表明,sPEG-LPD聚合物成功合成;sPEG-LPD在水中自组装成纳米粒,电镜下形态圆整,分布均匀,粒径约为151 nm,电位15 mV左右;在pH 6.5条件下PEG外壳脱去,粒径变小;血清稳定性、蛋白吸附、细胞毒性和溶血实验结果表明sPEG-LPD具有良好的安全性和稳定性。sPEG-LPD可以完全吸附pMETTL3质粒,最佳吸附比例为8:1,此时pMETTL3/sPEG-LPD粒径为122.6nm左右。（2）体外细胞实验结果表明pMETTL3/sPEG-LPD的细胞摄取呈现pH依赖性,在pH 6.5条件下脱去PEG外壳,正电荷增强,在去唾液酸糖蛋白受体（Asialoglycoproteinreceptors,ASGPR）介导的胞吞作用下进入细胞,发生溶酶体逃逸,具有较高的转染效率和基因编辑效率,能够显著下调METTL3蛋白的表达,并诱导细胞凋亡。（3）sPEG-LPD可以负载质粒,并选择性地在肿瘤组织蓄积,具有良好的体内靶向性。（4）pMETTL3/sPEG-LPD可以显著下调肿瘤组织的METTL3蛋白,促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤生长,发挥肝癌治疗作用。结论:制备了一种具有安全性、主动靶向性、pH敏感性的多功能纳米粒,可以在体内外高效递送CRISPR/Cas9质粒进入肿瘤细胞,发挥基因编辑作用,下调METTL3蛋白表达,显著抑制肿瘤生长,有效治疗肝癌。
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