论文部分内容阅读
目的:探讨岩黄连总碱对人肺腺癌A549细胞转移的影响及其与Vav1/Cdc42信号通路的关系。方法:在体外培养人肺腺癌A549细胞株至对数生长期,MTT法检测不同浓度的岩黄连总碱对A549细胞活力的影响。将人肺腺癌A549细胞株培养至对数生长期后,分为7组:阴性对照组、岩黄连总碱(1.25μg/mL)组、岩黄连总碱(2.5μg/mL)组、岩黄连总碱(5μg/mL)组、岩黄连总碱(10μg/mL)组、岩黄连总碱(20μg/mL)组、岩黄连总碱(40μg/mL)组。细胞划痕实验:将A549细胞接种于6孔板,设四组分别为阴性对照组、岩黄连总碱(5μg/mL)组、岩黄连总碱(7.5μg/mL)组、岩黄连总碱(10μg/mL)组,分别在0、24h两个时间点,利用倒置相差显微镜观察A549细胞迁移情况,并利用image Pro plus软件计算出划痕宽度,每孔至少测3处,实验重复三次,取平均值计算细胞迁移率。侵袭实验:将A549细胞接种于侵袭小室上室,设四组(同上),24h后将细胞固定、染色并利用倒置相差显微镜观察不同浓度的岩黄连总碱对A549细胞侵袭能力的影响,拍照并计数每组穿透的细胞个数,实验重复三次。Western-blot法检测不同浓度的岩黄连总碱作用后或其最适浓度联合加入Cdc42抑制剂后人肺腺癌A549细胞中Cdc42、MMP-2、MMP-9、蛋白的表达变化情况。荧光定量PCR法检测不同浓度的岩黄连总碱作用人肺腺癌A549细胞后,细胞中Cdc42mRNA、Vav1mRNA的表达情况。结果:MTT法检测结果显示低于10μg/mL浓度的岩黄连总碱对A549细胞活力的影响不大,因此低于此浓度范围内的药物作用细胞能保证细胞不处于病理情况下的迁移和侵袭。细胞划痕实验和细胞侵袭实验证实低浓度范围内的岩黄连总碱能抑制肺癌A549细胞的迁移和侵袭,且浓度越高抑制作用越明显。Western-blotting结果显示:岩黄连总碱能够抑制Cdc42、MMP-2、MMP-9蛋白的表达,(P<0.05);且浓度越高抑制作用越明显。加入Cdc42抑制剂后,MMP-9、MMP-2蛋白的表达减少,但联合加入适当浓度的岩黄连总碱后,它们的表达却没有进一步的减少。荧光定量PCR结果提示:岩黄连总碱可下调Cdc42mRNA的表达,上调Vav1mRNA的表达(P<0.05)。结论:较低浓度范围内的岩黄连总碱能抑制A549细胞的迁移及侵袭能力;岩黄连总碱可能通过下调Cdc42、MMP-2、MMP-9蛋白抑制A549细胞的转移,且可能以Cdc42基因为药物作用靶点,岩黄连总碱上调Vav1mRNA的机制有待进一步研究。