目的：左旋肉碱(L-β-羟基-γ-三甲氨基丁酸，L-β-Hrdroxy-γ-Brtyrobetaine)是一种小分子水溶性化合物，具有促进长链脂肪酸的β-氧化、促进能量的产生、抗氧化与清除自由基等多种重要生理功能。机体可少量合成左旋肉碱，大部分需要从饮食中获得。左旋肉碱的缺乏可导致疲劳、肌无力、心肌病、低血糖症及意识混乱等。人眼泪中可以检测到游离及乙酰化左旋肉碱存在。国外有研究表明，将左旋肉碱作为细胞的渗透压保护剂添加于用于治疗干眼症的人工泪液中，可显著改善干眼症患者的临床症状，但其作用机制未明，特别是泪液中的左旋肉碱是通过什么途径被转运入细胞内尚未见报道。　　近年来大量研究表明，有机阳离子转运蛋白(Organic cation transporter，OCTN)可转运肉碱进入细胞内，故又称肉碱/有机阳离子转运蛋白。OCTN包括OCTN1、OCTN2和OCTN3三个亚型。OCTNs在体内分布广泛，包括肾、脑、骨骼肌、心肌、乳腺以及胎盘组织中均有表达。虽然有功能性研究表明，兔眼结膜组织中存在载体介导的有机阳离子转运系统，但左旋肉碱在人角膜和结膜上皮细胞的转运机制尚不清楚。　　本研究拟从基因水平和蛋白水平上观察OCTNs在人眼角膜和结膜上皮细胞的表达与分布，并从功能上研究左旋肉碱在这些细胞的转运特性和动力学参数，以揭示左旋肉碱在人眼表上皮细胞的转运机制，为临床应用左旋肉碱治疗干眼症提供结构和功能基础，为进一步开发含左旋肉碱的人工泪液提供理论依据。　　方法：　　1在基因水平上采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)的方法检测OCTN1和OCTN2 mRNA在人角膜边缘上皮(Human corneallimbal epithelia，HCLE)细胞和人结膜上皮(Human conjunctival epithelia，HCjE)细胞的表达，并通过测定目的产物的核苷酸序列来确认扩增反应的特异性。　　2在蛋白水平上采用Western Blot、免疫细胞化学和免疫组织化学的方法观察OCTN1和OCTN2在HCLE和HCjE细胞及兔角膜上皮组织中的表达及亚细胞分布情况。　　3采用放射性摄入实验观察左旋肉碱转运的功能特性及动力学特征。将HCLE或HCjE细胞与[3H]标记的左旋肉碱在一定条件下孵育，然后洗涤并裂解细胞，测定细胞内放射性的摄入量，观察左旋肉碱摄入实验的饱和曲线、动力学参数等。　　按照Michaelis-Menten方程，通过非线性回归分析估计Km值和最大转运速率(Vmax)，公式如下：　　v=Vmax1×[s]/(Km1+[s])+Vmax2×[s]/(Km2+[s])　　其中v和[s]分别是底物的吸收速度和底物浓度，1和2分别代表高、低亲和力。以双倒数作图法(Lineweaver-Burk plots)确定Km和Vmax数值。　　4统计学分析所有实验结果以Mean±SD表示。应用SPSS13.0软件进行Students非配对t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。　　结果：　　1半定量RT-PCR分析结果显示，在HCLE和HCjE细胞中均检测到了OCTN1和OCTN2 mRNA扩增产物。通过序列分析证实了PCR扩增产物与目的基因的同一性。在HCLE细胞中，OCTN1的相对表达水平明显高于OCTN2，但在HCjE细胞中，OCTN1的相对表达水平则明显低于OCTN2。它们之间的差异具有统计学意义(P=0.002和P=0.004)。　　2采用免疫细胞化学的方法检测OCTN1和OCTN2蛋白的表达及其在细胞分布，结果显示：OCTN1和OCTN2在HCLE和HCjE细胞中均有表达，OCTN1主要分布在HCLE和HCjE细胞的细胞膜上，OCTN2的细胞定位与OCTN1基本相同。　　3进一步明确OCTN1和OCTN2在HCLE和HCjE细胞上表达的极性，采用超速离心法分别提取HCLE和HCjE细胞的顶端和基底端膜蛋白进行OCTN1和OCTN2的Western blot分析。结果显示，OCTN1和OCTN2两种转运蛋白均在细胞顶端出现明显强于基底端的条带，提示OCTN1和OCTN2主要位于HCLE和HCjE细胞的顶端。　　4免疫组织化学方法检测兔眼上皮细胞OCTN1和OCTN2的表达和定位，结果显示：OCTN1和OCTN2两种转运蛋白在兔角膜和结膜上皮强烈表达，并且主要位于上皮细胞的顶端面。另外，OCTN1在兔角膜和结膜上皮细胞表达基本相同，但对OCTN2来讲，其免疫反应性却与OCTN1不同，其在结膜上皮的免疫强度明显高于角膜上皮，此结果与mRNA的结果一致。　　5放射性摄入实验结果显示：HCLE和HCjE细胞对左旋肉碱的吸收具有浓度依赖性和饱和性。将饱和实验数据代入米氏方程(Michaelis-Menten models)进行非线性回归分析，Eadie-Hofstee法作图提示，在HCLE和HCjE细胞内存在高亲和力和低亲和力两种不同的肉碱转运系统，在HCLE细胞，高亲和力和低亲和力转运系统的米氏常数(Km)分别为9.48±2.7μM和363.64±34.4μM，最大转运速率(Vmax)分别为0.48±0.09 pmol/h/mg蛋白和5.1±0.3 pmol/h/mg蛋白；在HCjE细胞，其Km分别为9.39±1.3μM和196.03±17.1μM，Vmax分别为0.36±0.07pmol/h/mg蛋白和1.99±0.2 pmol/h/mg蛋白。　　结论：　　1人角膜和结膜上皮细胞存在OCTN1和OCTN2两种转运蛋白表达，并且OCTN1和OCTN2主要位于HCLE和HqE细胞的顶端。　　2在HCLE和HCjE细胞内存在高亲和力和低亲和力两种不同的肉碱转运系统，其转运动力学特征符合OCTN2的特点，提示OCTN2可能在人眼上皮细胞转运左旋肉碱过程中发挥主要作用。