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米糠多糖是米糠中的主要有效成分,具有良好的生物活性,但由于其分子量大、不易溶解、活性部位较少暴露等原因,限制了其作为功能性食品的使用。本文利用灰树花(Grifola frondosa)的胞内酶对米糠多糖进行酶法改性并比较了改性前后多糖的单糖组成、分子量、NK细胞活性及体外抗氧化活性。1、以灰树花的生物量和菌丝内可溶性蛋白的含量为指标,在单因素试验的基础上,通过正交试验优化,获得其最适液体培养基为:葡萄糖4%、蛋白胨1.5%、硫酸镁0.1%、p H为6.0;在该培养基中优化灰树花的液体培养条件为最适温度28℃、天数为8 d、转速为160 r/min;收集菌丝后采用85%硫酸铵沉淀的方法提取胞内酶,测得胞内蛋白浓度为65.6 mg/g,其中纤维素酶酶活为133.50±1.68 U/g、果胶酶酶活为60.46±0.20 U/g、淀粉酶酶活为44.74±0.54 U/g和木聚糖酶酶活为9.72±0.15 U/g。2、利用正交试验得到酶法协同超声提取米糠多糖的最佳工艺:米糠与水的料液比1:15,加入酶活力为3700 U/g的3%的α-淀粉酶在60℃,p H=6.0的条件下反应2h;加入酶活力为105U/g的3%的糖化酶在50℃,p H=5.0的条件下水解1h;加入酶活力为1200U/g的3%的的胃蛋白酶在38℃,p H=4.0的条件下水解1h后,100℃灭酶活处理10 min,在功率225 W,温度70℃的条件下超声80 min,4000 r/min离心10 min,取上清液为A液;向沉淀中按1:15料液比加入蒸馏水,将p H调至7,其余条件不变的情况下超声提取,离心取上清为B液;将A和B液混匀,醇沉后,多糖得率为7.88%;检测多糖的基本组成及理化性质,结果显示得到的米糠多糖纯度较高,总糖量约为84.15±0.88%,蛋白质含量为6.58±0.61%,为含有少许蛋白质的非淀粉性多糖。3、通过正交试验设计,以NK细胞提高率为衡量指标,利用灰树花胞内酶制备改性米糠多糖的最佳条件为酶:多糖为1:5、温度为40℃,p H=4.0,酶解时间为4 h,此条件下改性多糖m RBPSs-6的NK细胞杀伤活性最高,为12.01±0.08%;气相结果显示,m RBPSs-6的单糖组成及摩尔比为鼠李糖:阿拉伯糖:木糖:甘露糖:葡萄糖:半乳糖为7:21:6:5:53:48,而改性前的米糠多糖单糖比例为8:13:8:5:44:44;高效液相色谱分析结果表明,改性前米糠多糖的分子量约为106Da,改性后分子量降至104-105Da;根据抗氧化活性试验结果显示,m RBPSs-6在浓度为1.0 mg/m L时,可以高效率的清除DPPH·和·OH。本研究的结果为有效获得灰树花胞内酶及该酶在米糠多糖应用提供理论基础,同时也为改性多糖作为辅助医疗上的进一步开发应用提供技术支持。