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长链α,ω-二元酸是一种多用途的重要化工原料,广泛用于香料、聚合物以及粘合剂等化工产品的生产。热带假丝酵母(CandidaTropicalis)可以利用相应的烷烃和脂肪酸来合成从C11到C18的长链二元酸。该文以十三碳二元酸的生物法合成为研究对象,分别建立了热带假丝酵母生长期和产酸期的代谢网络模型,并在代谢流分析的基础上对菌种进行了优化筛选,对发酵工艺进行了合理的改进。
首先建立了热带假丝酵母F10-1生长期的代谢网络模型。根据底物的不同用途,进一步建立了热带假丝酵母在产酸期的动力学模型,由此得出烷烃在α,ω-氧化过程中的几次过膜所需要的能量为21ATP,并首次估算出了以烷烃为单一碳源的发酵过程中,最高理论摩尔转化率为64%,最高理论质量转化率为85%。在产酸期动力学模型的基础上,建立了热带假丝酵母F10-1产酸期的代谢网络模型。
构建了针对烷烃β-氧化减弱型和α、ω-氧化增强型菌株的筛选体系,即“两步浓缩法”和“双重影印技术”。通过这种体系,烷烃降解能力减弱以及产酸能力增强的1株优选菌株被高效地筛选出来。
对过氧化氢影响传氧和产酸的过程与机理进行了研究。摇瓶实验表明,加入适量的过氧化氢可以促进产酸。当过氧化氢加入量为2mM时,热带假丝酵母的产酸量比对照提高了30%。在发酵罐放大实验中,流加过氧化氢的发酵罐比对照罐产酸提高了14.5%。通过对过氧化氢促进产酸的机理的研究表明:
(1)过氧化氢,作为分子底物氧,可以减少气-液传质阻力,增加分子氧的供给。
(2)过氧化氢可以高效诱导细胞色素P450酶这-α,ω-氧化关键酶。
(3)当过氧化氢存在时,细胞可以通过更加有效的过氧化氢旁路途径来氧化烷烃。
进一步对P450酶进行了强化诱导研究。烷烃、Fe3+对P450酶有一定的诱导作用,苯巴比妥钠(SPB)、邻苯二甲酸异辛酯(MEHP)对P450酶没有诱导作用。对双诱导作用进行的研究表明,MEHP+烷烃对P450酶有很好的诱导作用。
建立了AOX酶的酶活检测方法,对AOX酶的底物特异性研究表明,热带假丝酵母CT1-12的AOX酶对十二碳醇有最高的活性,十三碳醇次之,而对其它链长的一元醇的活性则很弱。AOX酶催化十二碳醇氧化反应的动力学方程为v=0.0202cs/5.123+cs。过氧化氢对AOX酶具有一定的诱导作用,在2mM的H2O2诱导下,AOX酶活可以提高65.7%。
在进入产酸期48小时后补加蔗糖对产酸有明显的促进作用,在加入1%蔗糖的实验中,二元酸的产量提高了17.3%,烷烃的转化率最高达到了74%。丙二酸、氯丙嗪、2-溴代辛酸对β-氧化都有抑制作用。在控制一定浓度的情况下,都能够使产酸和烷烃转化率同时提高。