【摘 要】
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羊肚菌是子囊菌亚门中的珍稀药用真菌。多糖是羊肚菌的主要活性成分之一。目前已知羊肚菌多糖具有抗氧化、抗肿瘤和免疫调节等多种生物活性。但不同地域和不同栽培条件下的羊肚菌多糖在结构和功能活性上有一定的差异。本研究以湖北省武汉市农科院驯化栽培的六妹羊肚菌（Mel-6-13）为实验材料。通过分离纯化得到一种新的多糖MSP-3-1,进一步通过物理化学方法分析其结构特征,并探究其主要的生物活性。该结果将为羊肚菌
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羊肚菌是子囊菌亚门中的珍稀药用真菌。多糖是羊肚菌的主要活性成分之一。目前已知羊肚菌多糖具有抗氧化、抗肿瘤和免疫调节等多种生物活性。但不同地域和不同栽培条件下的羊肚菌多糖在结构和功能活性上有一定的差异。本研究以湖北省武汉市农科院驯化栽培的六妹羊肚菌（Mel-6-13）为实验材料。通过分离纯化得到一种新的多糖MSP-3-1,进一步通过物理化学方法分析其结构特征,并探究其主要的生物活性。该结果将为羊肚菌多糖的深入开发和利用提供理论基础。主要研究结果如下:MSP-3-1的提取纯化和成分分析:六妹羊肚菌多糖子实体通过热水浸提、AK-8大孔树脂除色素、Sevage法除蛋白、乙醇沉淀等方法得到初步纯化的多糖MSPs,多糖得率为6.82%。MSPs通过DEAE-52纤维素和Smartarose CL-4B琼脂糖凝胶进一步分离纯化得到多糖MSP-3-1。采用硫酸苯酚法测得MSP-3-1中多糖含量为98.62%,采用间羟基联苯法测得糖醛酸含量为1.27%,采用考马斯亮蓝染色法测得蛋白质含量为0.02%,采用氢化物原子荧光光谱法测得硒含量为1.14 mg/kg。这表明MSP-3-1是一种较为纯净的含硒多糖。MSP-3-1的结构分析:通过高效凝胶尺寸排阻色谱-十八角激光色散仪-示差折光检测仪（HPESC-MALLS-RID）测得MSP-3-1的分子量高达2.37×10~7Da,是目前从羊肚菌中分离纯化到的分子量最大的多糖。通过高效液相色谱（HPLC）分析表明MSP-3-1由葡萄糖、甘露糖和半乳糖组成,摩尔比分别为91.39:5.10:3.51,不含糖醛酸或其他单糖组分。通过傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、氢谱、碳谱核磁共振(~1H NMR、13C NMR)和甲基化进一步分析表明,MSP-3-1以1,4葡萄糖糖苷键（1,4-Glc）为主链,主要在在O-6位产生分支（1,2,6-Glc）并具有葡萄糖端基（T-Glc）,少量在O-2位和O-3位产生分支（1,2,4-Glc、1,3,4-Glc）。甘露糖以1,6糖苷键连接方式（1,6-Man）存在于MSP-3-1分子内部,半乳糖也是以端基（T-Gal）的形式存在。此外,还有少量葡萄糖以1,2糖苷键（1,2-Glc）方式连接,也在O-6位产生分支（1,2,6-Glc）。刚果红实验表明MSP-3-1无三螺旋结构,扫描电镜（SEM）表明MSP-3-1多糖在高倍镜下呈紧密的网状结构。纳米粒度-zeta电位分析表明MSP-3-1在溶液中呈一种均匀的纳米粒子,带微弱的负电荷。MSP-3-1的体外抗氧化活性分析:通过MSP-3-1对DPPH、羟基、ABTS自由基的清除能力分析得MSP-3-1具有一定的抗氧化活性,这可能与该多糖具有的网状结构有关。同时,这种网状结构多糖对铁钉抗腐蚀具有显著的效果。表明羊肚菌多糖MSP-3-1可作为一种优秀的天然材料应用于食品和工业领域。MSP-3-1的免疫调节活性分析:通过CCK-8法、中性红法和NO含量测定表明MSP-3-1不仅能促进RAW 264.7细胞的增殖和吞噬能力,还能提高对NO的释放。这表明MSP-3-1具有很强的免疫增强的作用。MSP-3-1的免疫增强活性可能与以1,4-α-葡萄糖连接的为主链,并在O-6具有分支的糖苷键结构有关。MSP-3-1对氧化应激损伤的保护作用分析:通过CCK-8法、ROS含量测定和Western blot检测表明MSP-3-1能促进由H2O2诱导的氧化应激损伤Hep G2细胞的生长,降低细胞内ROS的产生,并使得促进调亡的蛋白Bax和Cyt-c表达量减少,抑制调亡的蛋白Bcl-2表达增加,这表明MSP-3-1能保护因氧化应激引起的损伤。这可能与MSP-3-1具有的抗氧化性和免疫调节作用有关。
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