草莓果实特异性启动子的克隆与功能分析

来源 :山东大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:renxin216
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
组成型启动子是植物基因工程中广泛应用的启动子类型之一,可启动外源基因在受体植物中非特异性的持续、稳定的表达,但不能从时间和空间上对外源基因的表达进行有效的调控,这可能会造成植物在能源利用上的浪费,甚至会对转基因植物造成伤害。组织特异型启动子可以启动外源基因在受体植物的特定组织器官中高效表达,果实特异性启动子作为重要的组织特异性启动子,可以控制外源基因在转基因植物的果实中特异表达。克隆和研究果实特异性启动子,可为改良果实品质奠定基础。 从Genbank中筛选了一个由差减文库筛选得到的草莓基因组EST序列(Accession number:DY633382),将推测对应的基因简称DY基因。对此EST序列进行同源性分析,发现它与葡萄中的一个与果实成熟相关的丝氨酸/苏氨酸激酶基因有很高的相似性(83%)。进而,对草莓(Fragaria ananassa,Duch.cv Chandler)中DY基因的表达模式进行RT-PCR分析,结果显示DY基因在果实中特异表达,且在不同发育时期表达量存在差异。在绿色果实期转录水平最高,在白色果实期转录水平最低,在转变期和红色果实期转录水平较白色果实期有所升高,但比绿色果实期稍低。RT-PCR结果表明DY基因是果实表达特异性的基因。 根据EST:DY633382序列设计特异引物,利用TAIL-PCR克隆得到了DY基因的起始密码子上游的1021bp启动子序列。利用在线生物信息学软件NSITE和PLACE分析该序列,结果表明DY基因启动子区TATA-box位于起始位点上游的-32~27区段,该序列包含有18个可能的顺式作用元件,如CCGTCG motif、GA-1、AT-rich F等。利用PCR获得了DY基因启动子序列三个缺失片段,分别构建植物表达载体pCAMBIA1305-DI-GUS、pCAMBA1305-DⅡ-GUS、pCAMBA1305-DⅢ-GUS。然后利用农杆菌浸染的方法转化烟草,通过PCR和Sourthern杂交分析的方法鉴定单拷贝插入的转基因植株。转基因烟草植株的组织化学染色分析结果表明启动子序列的不同缺失片段都可以启动GUS基因在果实(子房)中特异性表达,在叶片、根、茎和花中没有表达。GUS组织染色结果说明在启动子的-523到转录起始位点的区段存在调控基因果实特异表达的顺式元件。植物表达载体pCAMBIA1305-DI-GUS、pCAMBIA1305-DⅡ-GUS、pCAMBIA1305-DⅢ-GUS在烟草果实(子房)中的表达强度比组成型表达载体pCAMBIA1305在烟草果实(子房)中的GUS基因表达强度要低。在烟草果实发育时期I,转pCAMBIA1305-DⅡ-GUS和pCAMBIA1305-DⅡ-GUS表达载体的转基因烟草果实的GUS酶活性比pCAMBIA1305-DⅢ-GUS的表达强度高,且差异较大,推测存在于DY调控序列-699~-523区段的AT-rich F有增强基因表达的作用。 HyPRP基因在草莓果实中特异表达,其产物HyPRP是一类富含脯氨酸的细胞壁结构蛋白,与草莓果实成熟过程中果实内多酚的锚定有关。利用PCR方法得到了肋HyPRP基因的778bp的启动子序列。利用在线生物信息学软件NSITE和PLACE分析该778bp启动子序列,结果表明在HyPRP启动子序列中,TATA-box位于起始密码子上游-59~-56区段,包含有23个可能的上游元件,如ABRE、ACGT box、GT motif等。利用PCR扩增了HyPRP基因启动子序列的两个缺失片段,分别构建了植物表达载体pCAMBIA1305-H I-GUS、pCAMBIA1305-HⅡ-GUS,然后利用农杆菌介导的方法转化烟草。对转基因烟草的GUS活性分析显示,pCAMBIA1305-HⅠ-GUS和pCAMBIA1305-HⅡ-GUS中的GUS基因在转基因烟草果实(子房)中特异表达,说明启动子序列-581到起始密码子的序列上存在调控基因果实特表达的顺式作用元件。通过GUS酶活分析发现,转化pCAMBIA1305-HI-GUS的转基因烟草果实(子房)酶活性大大高于转化pCAMBIA1305-HⅡ-GUS的。可能在-778~-581区段存在增强基因表达的顺式作用元件,pCAMBIA1305-HⅡ-GUS由于缺失了该元件而导致GUS基因表达减弱。
其他文献
摘要:文言文教学往往关注“古今言殊”的因素,着重疏通文意;在分析内容时又照搬教参,千篇一法,教师教得累,学生学得苦。教学源于巧思,文言文教学需要有创造性的教师对文本进行“微研究”,唯有通过对教材的创意解读,以巧问、趣问为切入点,将古文化难为易,使学生乐学,从而领略古文之美。  关键词:文言文;微角度;创意解读;切入点现在学生界流传一句话:一怕文言文,二怕周树人,三怕写作文 。可见学生对文言文的反感
  本文认为,一个图书馆的地方文献工作水平如何,发展程度怎样,更多情况下完全取决于馆长的认识水平和相关馆员的工作态度,这也成为地方文献工作成败要素。顺延提出对地方文献概
  收集整理地方文献是县级图书的一项重要工作,本人近四年在从事地方文献的收集整理工作中,分析了地方文献的内容和特点,地方文献在地方的社会发展中的作用以及收集整理过程中
  本文以杭州图书馆为例,通过探讨地方文献的含义、征集原则、范围、渠道方法,从而使市级公共图书馆加强对本市所辖行政区域内各民族地方文献征集工作的重视,进而促进本市地方
  人类的交流从来都是先从声音开始的。在民族地区地方文献的收集与保护中,往往却忽视了录音、录像带模拟型载体文献的收集和保护。然而,这类文献,恰恰是最早记录地方民族历史
摘要:情景教学法是现代语文教学中十分重要的一种教学方法,是新课改背景下语文教学理念的重要体现,是对学生进行语文素养培养的有效途径。因此,我们应该充分认识到情境教学法在语文教学中的重要价值。  关键词:情境教学法;初中;语文语文教育涉及认知、情感、性格等方面,具有多方面的综合价值,因此采用情境式教学,更有利于语文综合价值的发挥。将情境教学法应用到初中语文教学中,构建教学情境,营造良好的学习氛围,能够
  文章通过对三十年(1980-2010)贵州民族文献资源的学科主题统计、民族主题统计及作者分布统计进行分析,概括出贵州民族文献资源的七个基本特征,以此为基点,对进一步开展好民
目前,荧光半导体纳米粒子(NPs),又称为荧光半导体量子点(QDs),在生物医学研究中应用的可行性和重要意义已经是有目共睹,相关的研究理论、合成制备和应用成果日益增多。目前在
  文章以什么是民族地区文化、什么是民族地区文献为论点,以民族地区公共图书馆为什么要对民族文献进行收集、保存和传播进行有理有据的论证,以辽文化为背景,以辽代遗址、遗迹
  延边朝鲜族自治州图书馆依托朝鲜族厚重的文化底蕴和地区独特丰富的地方文献资源,有计划、有系统地收集、整理、发掘了民族地方文献资料。这对了解朝鲜族文献形成的历史文