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组成型启动子是植物基因工程中广泛应用的启动子类型之一,可启动外源基因在受体植物中非特异性的持续、稳定的表达,但不能从时间和空间上对外源基因的表达进行有效的调控,这可能会造成植物在能源利用上的浪费,甚至会对转基因植物造成伤害。组织特异型启动子可以启动外源基因在受体植物的特定组织器官中高效表达,果实特异性启动子作为重要的组织特异性启动子,可以控制外源基因在转基因植物的果实中特异表达。克隆和研究果实特异性启动子,可为改良果实品质奠定基础。
从Genbank中筛选了一个由差减文库筛选得到的草莓基因组EST序列(Accession number:DY633382),将推测对应的基因简称DY基因。对此EST序列进行同源性分析,发现它与葡萄中的一个与果实成熟相关的丝氨酸/苏氨酸激酶基因有很高的相似性(83%)。进而,对草莓(Fragaria ananassa,Duch.cv Chandler)中DY基因的表达模式进行RT-PCR分析,结果显示DY基因在果实中特异表达,且在不同发育时期表达量存在差异。在绿色果实期转录水平最高,在白色果实期转录水平最低,在转变期和红色果实期转录水平较白色果实期有所升高,但比绿色果实期稍低。RT-PCR结果表明DY基因是果实表达特异性的基因。
根据EST:DY633382序列设计特异引物,利用TAIL-PCR克隆得到了DY基因的起始密码子上游的1021bp启动子序列。利用在线生物信息学软件NSITE和PLACE分析该序列,结果表明DY基因启动子区TATA-box位于起始位点上游的-32~27区段,该序列包含有18个可能的顺式作用元件,如CCGTCG motif、GA-1、AT-rich F等。利用PCR获得了DY基因启动子序列三个缺失片段,分别构建植物表达载体pCAMBIA1305-DI-GUS、pCAMBA1305-DⅡ-GUS、pCAMBA1305-DⅢ-GUS。然后利用农杆菌浸染的方法转化烟草,通过PCR和Sourthern杂交分析的方法鉴定单拷贝插入的转基因植株。转基因烟草植株的组织化学染色分析结果表明启动子序列的不同缺失片段都可以启动GUS基因在果实(子房)中特异性表达,在叶片、根、茎和花中没有表达。GUS组织染色结果说明在启动子的-523到转录起始位点的区段存在调控基因果实特异表达的顺式元件。植物表达载体pCAMBIA1305-DI-GUS、pCAMBIA1305-DⅡ-GUS、pCAMBIA1305-DⅢ-GUS在烟草果实(子房)中的表达强度比组成型表达载体pCAMBIA1305在烟草果实(子房)中的GUS基因表达强度要低。在烟草果实发育时期I,转pCAMBIA1305-DⅡ-GUS和pCAMBIA1305-DⅡ-GUS表达载体的转基因烟草果实的GUS酶活性比pCAMBIA1305-DⅢ-GUS的表达强度高,且差异较大,推测存在于DY调控序列-699~-523区段的AT-rich F有增强基因表达的作用。
HyPRP基因在草莓果实中特异表达,其产物HyPRP是一类富含脯氨酸的细胞壁结构蛋白,与草莓果实成熟过程中果实内多酚的锚定有关。利用PCR方法得到了肋HyPRP基因的778bp的启动子序列。利用在线生物信息学软件NSITE和PLACE分析该778bp启动子序列,结果表明在HyPRP启动子序列中,TATA-box位于起始密码子上游-59~-56区段,包含有23个可能的上游元件,如ABRE、ACGT box、GT motif等。利用PCR扩增了HyPRP基因启动子序列的两个缺失片段,分别构建了植物表达载体pCAMBIA1305-H I-GUS、pCAMBIA1305-HⅡ-GUS,然后利用农杆菌介导的方法转化烟草。对转基因烟草的GUS活性分析显示,pCAMBIA1305-HⅠ-GUS和pCAMBIA1305-HⅡ-GUS中的GUS基因在转基因烟草果实(子房)中特异表达,说明启动子序列-581到起始密码子的序列上存在调控基因果实特表达的顺式作用元件。通过GUS酶活分析发现,转化pCAMBIA1305-HI-GUS的转基因烟草果实(子房)酶活性大大高于转化pCAMBIA1305-HⅡ-GUS的。可能在-778~-581区段存在增强基因表达的顺式作用元件,pCAMBIA1305-HⅡ-GUS由于缺失了该元件而导致GUS基因表达减弱。