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巨噬细胞天然抗性蛋白1（natural resistance-associated macrophage protein I，Nramp1）是含有12个跨膜域的膜蛋白，定位于溶酶体膜表面，能够抑制布鲁氏菌、结核杆菌、沙门氏菌等胞内寄生菌的增殖。本研究从秦川牛中克隆了Nramp1基因，对Nramp1的亚细胞定位、抑制胞内菌生长的功能和转Nramp1基因克隆牛的研制等进行了研究，主要得到以下结果：1.本研究通过RT-PCR的方法从秦川牛脾脏中扩增了牛Nramp1基因的编码区序列，测序表明秦川牛Nramp1基因的两个核苷酸位点存在单核苷酸多态性；同时克隆了Nramp1基因的同源异构体NRAMP1-ISO，NRAMP1-ISO基因比Nramp1基因多了第三内含子，NRAMP1-ISO终止密码子位于第三内含子内，NRAMP1-ISO共编码200个氨基酸。真核表达载体pEGFP-NRAMP1在细胞质的溶酶体表达，而pEGFP-NRAMP1-ISO在细胞核和细胞质中都有表达。2.本文构建了EGFP标记的NRAMP1不同编码区域的融合表达载体，与定位于溶酶体的特异性载体Lamp1-RFP共转染CHO细胞中，筛选NRAMP1蛋白中与溶酶体定位有关的氨基酸序列。研究结果表明，氨基端的包含第二个跨膜域的AA.73-140区域、含有327YAPI330结构域的AA.263-334区域、含有MORN结构域的AA.372-430区域和两个内部信号肽AA.430-451与AA.489-522等都能够将NRAMP1定位到溶酶体上。3.本研究构建了Nramp1的表达载体pCMV-NRAMP1-HA（简称pCMV-N）和巨噬细胞特异性表达载体pSP-NRAMP1-HA（简称pSP-N）。将两个载体分别稳定转染入NRAMP1蛋白功能缺陷的小鼠巨噬细胞系RAW264.7，经RT-PCR和免疫荧光检测表明pCMV-N和pSP-N都能在RAW264.7细胞中表达。分别用牛布鲁氏菌强毒株2308和羊沙门氏菌感染转染牛Nramp1基因的和未转染的RAW264.7细胞，验证牛Nramp1基因的抗菌功能；结果表明，与未转染的细胞相比，牛Nramp1基因能够显著地抑制胞内菌的增殖与生长。4.通过组织块培养法分离培养秦川犊牛的耳皮肤成纤维细胞（BEF），用pSP-N转染BEF，加入G418进行筛选，并经PCR鉴定，获得了整合有外源Nramp1基因的单克隆细胞。进一步研究表明2号转基因单克隆细胞（SP-BEF2）的生长活力与未转染的BEF类似，且SP-BEF2的染色体核型正常（2n=60，XX）。用SP-BEF2和BEF作为供体细胞制备克隆胚胎，两者胚胎的卵裂率和囊胚率差异不显著（P>0.05）。5.用转基因细胞株SP-BEF2作为供体细胞，通过核移植制备克隆胚胎，移植到43头秦川受体牛，其中14头受体牛怀孕，1头受体牛妊娠200天时产下胎儿，经PCR鉴定表明，该流产胎儿基因组中整合有外源Nramp1基因。