随着食品加工业的发展,食品过敏问题也越来越严重,虾是八大过敏原海鲜中的一大类,每年都有很多人因食用虾及其制品而导致严重过敏反应。研究发现加热、辐照、高压、酶解等都可降低虾过敏原的致敏性。近年来的研究已明确虾主要过敏原的结构、表位、关键氨基酸等信息,我们已知食物过敏一般是发生在人体食入过敏原之后,而人体消化系统对过敏原的结构、表位等都会产生影响,从而引起过敏原及其抗原表位的致敏性的变化,探讨人体消化系统对过敏原及其抗原表位的影响对分析过敏机制和制备脱敏食物都具有重要的意义。本文通过提取纯化虾过敏原Pen a1,合成Pen a1抗原表位的5个多肽片段No.1-No.5(分别为表位No.1:Pen a143-57;表位No.2:Pen a185-105;表位No.3:Pen a1133-148;表位No.4:Pen a1187-202;表位No.5:Pen a1247-284),制备免疫原并免疫兔子获得全抗体和特异性表位抗体。体外模拟人体胃液、肠液和胃肠液消化Pen a1及表位多肽,用全抗体和表位特异性抗体检测其免疫原性的变化,并结合表位多肽自身的消化稳定性,分析Pen a1经消化后免疫原性的变化规律。主要研究内容及结果如下:(1)通过KCl抽提、硫酸铵分级沉淀、等电点沉淀等方法提取纯化虾过敏Pen a1,采用Fomc化学法合成Pen a1的5个表位多肽,用Pen a1和表位多肽制备免疫原免疫纯种新西兰大白兔,获得全抗体和表位特异性抗体,抗体效价高、灵敏度强。(2)对Pen a1及其表位多肽进行240 min的模拟胃液消化试验,结果表明,Pen a1经消化后免疫原性降低,各抗原表位消化稳定性排序为No.4>No.2>No.1>No.3>No.5,表位多肽自身的消化稳定性为No.1>No.2>No.3>No.4>No.5。结合免疫印迹结果可知No.4抗原表位消化稳定性最高;No.1、2、3次之,三个表位间无显著性差异;No.5消化稳定性最差。(3))对Pen a1及其表位多肽进行240 min的模拟肠液消化试验,结果表明,Pen a1的免疫原性在消化60 min内下降显著,在90 min后下降缓慢,生成的新片段仍具有免疫原性,但会逐步完全分解至SDS-PAGE无法检测出;Ci-ELISA检测可知经过肠液消化后Pen a1各表位消化稳定性为No.2>No.1>No.3>No.4>No.5;5个表位多肽的消化稳定性为No.3>No.1>No.4>No.2>No.5,与各表位上的酶切位点的个数呈负相关。综合可以得出Pen a1中No.2表位具有最高的消化稳定性,No.1、3、4次之,No.5表位消化稳定性最差。(4)对Pen a1及其表位多肽进行120 min的模拟胃液消化和240 min的模拟肠液消化试验,结果表明,利用SDS-PAGE和免疫印迹(Western-blot)观察消化后Pen a1逐渐被分解,生成的片段仍具有免疫原性,这些片段与全抗体结合的最多,No.3、4抗体次之,No.5较少,No.1、2基本无结合作用;竞争抑制酶联免疫吸附试验(Ci-ELISA)定量检测表明Pen a1和表位多肽消化后与各抗体的结合能力,综合分析得出经GI消化后,Pen a1的5个抗原表位的消化稳定性为No.2>No.4>No.3>No.1>No.5,5个表位多肽的消化稳定性为No.3>No.1>No.2>No.4>No.5,可知经过胃肠液消化后No.2表位具有最高的消化稳定性,No.5消化稳定性最差。分析以上三种消化条件,No.4在胃液中消化稳定性最高,而在肠液中稳定性差,因而经过胃肠液综合消化后,其稳定性较低;No.2表位的消化稳定性在胃液中较高,仅次于No.4,在肠液中稳定性最高,使得经过胃肠液消化后具有最高的稳定性,这可能是因为Pen a1空间结构对其起着一定的保护作用。No.5表位由于其位于蛋白末端、抗原表位长、酶切位点多等原因,在三种条件下消化稳定性均最差。综上所述,No.4在胃液消化中稳定性最高,No.2在肠液消化和胃肠液综合消化中稳定性均最高,No.5在三种消化条件下稳定性均最差。本研究可用于未来治疗虾过敏患者和虾过敏机理的研究。