研究背景及目的龋病是在以细菌为主的多因素作用下,牙体硬组织发生的慢性、破坏性、细菌感染性疾病。变异链球菌（Streptococcus mutans,S.mutans）是致龋微生物中最主要的细菌之一。强耐酸性是S.mutans 重要的致龋毒力之一,也是其作为致龋菌的重要生物学特性。耐酸性是S.mutans适应牙菌斑动态变化酸性环境关键的生存机制,但其分子机制目前尚未完全明了。随着现代分子生物学各项研究技术的发展,越来越多的与S.mutans耐酸性相关的基因及其相关蛋白被发现,为进一步阐明耐酸反应的机制奠定基础。蛋白质翻译后修饰可以调控细胞内许多蛋白质的功能或细胞的许多生理反应,比如细胞对外界环境的应答反应等。乙酰化修饰是动态的、可逆的蛋白质翻译后修饰,和磷酸化修饰一样,在生物体内是重要而且广泛存在的,如参与物质的代谢、蛋白质的稳定性、DNA与蛋白质的相互作用、致病微生物的致病过程等。乙酰化过程由乙酰基转移酶和去乙酰化酶协同调控。乙酰基转移酶对细菌形态,生长代谢和压力应激反应具有重要作用。S.mutans UAI59中SMU.2055蛋白被认为是假想的乙酰基转移酶。这类酶的作用主要是将乙酰辅酶A（AcCoA）上的乙酰基团转移给底物上的氨基,选择性乙酰化4⁵个氨基之一。有学者发现,乙酰基转移酶的提高,除了会导致细胞浓度的增加,还能够增强大肠杆菌抗热和抗氧化的能力。赖氨酸的乙酰化能够提高大肠杆菌在不同环境刺激下的生存能力。调节蛋白质乙酰化状态可以影响细胞膜的结构和通透性,影响细菌形态和生物膜的形成。前期我们已通过基因克隆,蛋白质纯化,晶体筛选,解析了 SMU.2055蛋白的三维晶体结构,该结构被收录于PDB（protein data bank）,编号为3LD2,运用计算机辅助药物设计方法,设计并筛选出5个与SMU.2055蛋白结构匹配度高的小分子化合物,建立了S mu ans UA159蛋白抑制剂的虚拟筛选模型,旨在通过小分子抑制剂改变S.mutans 致龋性。然而,目前国内外对于SMU2055基因功能的研究尚且缺乏。为了研究SMU.2055基因在S mutans中发挥的作用,本研究拟通过构建SMU.2055基因缺陷菌株,观察SMU.2055基因缺陷菌株的形态结构,研究其耐酸性的变化以及可能影响因素,探讨SMU2055基因在S.mutans 耐酸性中发挥的作用,探究SMU.2055基因功能,对寻找龋病防治的有效靶标具有重要意义。第一章 变异链球菌SMU205-5基因缺陷菌株的构建目的:构建SMU2055基因缺陷菌株。方法:依据NCBI提供的野生型S.mutans UA159全基因组序列,利用Primer Premier 5.0软件设计并合成SMU2055基因上下游引物,PCR扩增SMU2055基因的上、下游片段,以pFW5质粒为载体,使用限制性内切酶BamH I和Hind Ⅲ经双酶切后与pFW5质粒进行连接,将连接反应产物转化入E.coli DH5α感受态细胞,利用选择性LB培养基过夜培养,筛选阳性克隆,提取质粒进行测序鉴定。使用1μg/mL的感受态刺激肽将构建成功的SMU.2055基因缺陷重组质粒转化入野生型S.mutans,构建SMU2055基因缺陷菌株。利用选择性BHI培养基筛选阳性克隆,提取阳性克隆的基因组DNA进行PCR及测序鉴定。结果:经过PCR和测序鉴定,SMU2055基因缺陷菌株构建成功。第二章 变异链球菌SMU.2055基因对耐酸性作用的影响目的:扫描电镜,透射电镜下观察野生型S.mutans UA159、SMU2055基因缺陷菌株的形态结构,研究两种菌株在不同pH条件下的生长、致死性pH值、糖酵解能力、细胞通透性、质子通透性、H+-ATPase活性及生物膜形成能力,探究SMU.2055基因在Smutans耐酸性中发挥的作用,进一步研究SMU.2055基因的功能。方法:1.扫描电镜（SEM）观察。S.mutans UA159及SMU2055基因缺陷过夜培养,调节菌液OD600≈0.8,1:100稀释,37℃厌氧培养16h后,弃去菌液,取出盖玻片,2%戊二醛固定1h,乙醇梯度脱水30min,干燥,喷金,扫描电子显微镜下观察细菌形态。2.透射电镜（TEM）观察。S.mutans UA159及SMU2055基因缺陷菌株过夜培养,调节菌液OD600≈0.8,按1:100加入液体培养基中,37℃厌氧培养至对数生长期,3000 r/min离心,去上清液后加入0.3%戊二醛预固定15-30 mim,10,000 r/min离心15 min,采用2%戊二醛固定,1%四氧化锇再固定,丙酮梯度脱水,包埋,切片,醋酸铀及枸橼酸铅双重染色,透射电子显微镜观察。3.探究两种菌株在不同pH条件下的生长情况。将过夜培养的S.mutans UA159和SMU2055基因缺陷菌株清洗,离心,重悬,调整OD600约相等,按1:100加入新的pH 7.5或pH 5.5 BHI培养基中,37℃,厌氧培养。每1h取1mL菌液,测量各菌液的OD600值,连续监测24 h,绘制各菌株的生长曲线。4.致死性pH值实验。将S mutans UA159和SMU.2055基因缺陷菌株培养至对数中期,转入以0.5为间隔的pH值为2.5-7.0的BHI液体培养基。厌氧培养3h后取样,稀释,涂板,48 h后计数活菌数。5.探究两菌株糖酵解能力。将S.mutans UA159和SMU.2055基因缺陷菌株培养至静止早期,重悬于50mMl KC1,1mM MgCl2溶液中。KOH滴定至pH 7.2以上,加葡萄糖至终浓度为1%,每隔2 min检测菌液pH值,连续监测30 min。pH所能达到的最低值为糖酵解最低pH值。6.探究两菌株细胞通透性。将S.mutans UA159和SMU2055基因缺陷菌株过夜培养后,取25 mL重悬在2.5 mL Tris-HC1缓冲液中（75 mM,pH 7.0,含有10 mM MgSO4）。加入250μL甲苯,37℃孵育5 min,冻融,重悬,根据BCA蛋白浓度测定试剂盒使用说明书检测蛋白浓度。7.探究两菌株质子通透性。将S.mutans UA159和SMU.2055基因缺陷菌株过夜培养,重悬于PBS缓冲液,孵育2 h。离心,重悬于50 mM KC1、1mM MgC12溶液中至浓度达到20 mg/mL。调节pH至4.7以下,每10 min测量菌液pH值,在50 min时加入终浓度为10%的丁醇,80 min时记录最终pH。8.探究两菌株不同pH条件下H+-ATPase活性。将制备好的通透细胞（pH值为7.5或5.5）重悬于75mMTirs-HC1缓冲液（pH7.0,含1lmMMgSO4）。取3mL菌液,以同样的缓冲液为空白对照,测菌液OD600。依据细胞干重与吸光度的关系曲线,推算出菌液浓度。根据H+/K+-ATP酶测定试剂盒使用说明书进行酶促反应,定磷。计算出不同pH条件下的H+-ATPase活性。9.探究两菌株不同pH条件下生物膜形成情况。S.mutans UA159和SMU.2055基因缺陷菌株过夜培养后,按1:100加入BHI液体培养基（pH值为7.5或5.5）,取5 mL,分别转移至已放置无菌盖玻片的六孔板中,厌氧培养24 h后,洗涤,干燥,使用SYT09对细菌形成的生物膜进行染色,激光共聚焦显微镜观察,随机选择5个视野进行拍照。10.实验均重复三次,采用SPSS 20.0软件进行两独立样本t检验,检验水准为α=0.05,P<0.05代表具有统计学差异。结果:1.SEM结果显示,SMU.2055基因缺陷株形态及菌体间物质出现明显的改变。野生型S.mutans UA159细菌形态规则,包膜光滑完整,呈球杆状,菌体间存在不规则物质。而SMU.2055基因缺陷菌株菌体较野生型的长,部分细菌呈团块状分布,菌体间不规则物质较少。2.TEM观察,野生型S.mutams UA159形态正常,细胞膜结构完整,分裂状态下细菌两级对称,分裂后细菌形态一致。SMU2055基因缺陷菌株细胞膜较模糊,完整性被破坏。3.与野生菌株相比,SMU.2055基因缺陷菌株在pH 7.5和pH 5.5的BHI培养基中的早期生长均受到明显的影响。缺陷菌株的迟缓期延长,进入平台期所需要时间增多。pH 5.5时两种菌株早期的OD600明显低于pH 7.5时,菌株的生长受到抑制,缺陷菌株生长受抑制情况更加明显,20 h后两种菌株在pH 7.5和pH 5.5时的终末菌液浓度没有明显差异。4.随着pH值逐渐下降,两种菌株生存能力逐渐减弱。野生型Smu0ans UA159的致死性pH值为3.5,SMU2055基因缺陷菌株的致死性pH值为4.0。5.在前18 mim的各个时间点上,UA159反应体系的pH值均低于缺陷菌株,早期野生菌株糖酵解速率明显高于缺陷菌株,差异具有统计学意义（P<0.05）。但两者糖酵解的最低pH值没有统计学差异。说明SMU2055基因的缺失没有影响细菌的糖酵解能力。6.野生型 S.mutans UA159 的蛋白浓度为 1.2768±0.2639 mg/mL,SMU2055基因缺陷菌株的蛋白浓度为1.6297±0.1249 mg/mL,与野生型相比,SMU2055基因缺陷菌株细胞通透性增强,差异具有统计学意义（P<0.001）。7.SMU2 55基因缺陷菌株在50 min到80 min时曲线的斜率小于野生菌株,80mim时pH值低于野生菌株,差异具有统计学意义（P<0.05）。说明SMU.2055基因缺陷菌株对质子的通透性增强。8.pH 7.5时,与野生型S.mutans UA159相比,SMU.205₅基因缺陷菌株的H+-ATPase活性略微降低,差异没有统计学意义（P>0.05）。pH 5.5时,SMU.2055基因缺陷菌株的H+-ATPase活性明显低于野生菌株,差异具有统计学意义（P<0.01）。9.在pH 7.5和pH 5.5时,野生型SmutansUAI59形成的生物膜较为致密,细菌团块较大,SMU.2055基因缺陷菌株所形成的生物膜较野生型稀疏,细菌团块较小,呈网状结构,存在不规则圆形或椭圆形大小不一的孔隙。SMU2055基因缺陷菌株形成生物膜的能力均明显低于野生菌株。在pH 5.5时两种菌株形成生物膜的能力均高于pH 7.5时,且形成的生物膜更加致密,细菌团块更大,几乎遍布整个视野。结论:1.S.mutans中SMU2055基因与耐酸性密切相关。2.SMU.2055基因的缺陷可能影响细菌细胞膜结构,影响S.mutans在不同pH条件下的早期生长、致死性pH值、细胞通透性、质子通透性、pH 5.5时H+-ATPase活性及生物膜形成能力,但与其糖酵解能力无关。