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目的
肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一种常见的功能性胃肠道疾病，该病具有十分典型的临床症状，例如腹痛、腹部不适、排便习惯改变和大便异常[1]。该病的病因和发病机制尚未完全明确，其中肠黏膜屏障功能受损可能为主要因素之一。紧密连接结构作为肠黏膜屏障的重要构成部分，分布于肠黏膜细胞膜的顶端和边缘处，IBS患者在临床中发现大多会存在肠黏膜紧密连接结构的异常和通透性改变，提示上述结构可能与IBS发病有相关性[2]。因此本实验采用急性应激与慢性应激相结合的方法制备IBS-D大鼠模型，在造模的同时使用电针疗法进行干预，从肠黏膜屏障机制入手，以紧密连接结构为切入点，观察电针不同穴位对IBS-D大鼠的行为学、肠上皮黏膜组织形态学改变以及相关蛋白表达的影响，阐明电针对紧密连接结构的保护作用，希望为临床上治疗肠易激综合征提供实验基础。
方法
共使用40只12周龄大的SPF级雄性SD大鼠，体重180-200g，适应性喂养1周后，采用随机数字表法分为四组，每组10只，分别为：空白组、模型组、合募配穴组、常规配穴组。通过急性应激与慢性应激相结合的方法，创建IBS-D大鼠模型，造模时间为28天。在造模的同时对大鼠进行电针干预，空白组饲喂普通饲料，不作其他处理；模型组在造模的同时，每日进行抓取训练、鼠衣穿脱训练；合募配穴组在造模同时采用电针双侧足三里、天枢穴治疗，连续波2HZ，电流强度1mA，每日治疗1次，每次15分钟；常规配穴组在造模同时，采用针刺双侧足三里、上巨虚穴治疗，连续波2HZ，电流强度1mA，每日治疗1次，每次15分钟。造模和电针干预结束后，观察大鼠一般情况及体征、HE染色法观察大鼠结肠组织的形态学改变；免疫组化法(Immunohistochemical)检测结肠组织紧密连接蛋白Occuldin、Claudin-1的阳性表达；免疫印迹法(Western blot)检测结肠中Occuldin、Claudin-1蛋白的表达水平。
结果
1.各组大鼠一般情况和体质量的观察
在大鼠一般情况方面，空白组在造模前后精神状态、活动情况、毛发光泽度和粪便性状无明显变化；模型组在造模中后期出现神情倦怠、行动迟缓、毛发枯黄掉落和粪便稀溏秽臭的情况，提示造模较为成功；合募配穴组和常规配穴组在造模＋干预中后期一般情况明显好转，精神变好，粪便性状由稀溏逐渐变干，提示电针干预对大鼠的一般情况有改善作用。
在大鼠体质量方面，与空白组相比，模型组、合募配穴组和常规配穴组大鼠在造模开始后体重的增长速度有所减缓，差异有统计学意义(P＜0.05)；与模型组相比，在造模＋干预中后期，合募配穴组和常规配穴组体重有较为明显的增长，差异有统计学意义(P＜0.05)；与常规配穴组相比，在造模＋干预后期合募配穴组体重增长幅度较优，差异有统计学意义(P＜0.05)。
2.各组大鼠Bristol评分、糖水偏好结果、AWR评分的比较观察
在大鼠Bristol评分方面，与空白组相比，模型建立后的各组大鼠Bristol评分增加，差异有统计学意义(P＜0.05)；与模型组相比，施以电针干预的两组大鼠其Bristol评分明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；比较合募配穴组和常规配穴组，差异无统计学意义(P＞0.05)。
在糖水偏好实验结果的比较中，造模前所有组大鼠的SP值未见明显差异。与空白组相比，模型组、合募配穴组和常规配穴组SP值降低明显，差异有统计学意义(P＜0.05)；与模型组相比，电针后合募配穴组和常规配穴组大鼠的SP值均升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与常规配穴组比较，合募配穴组的SP值相对较高，差异有统计学意义(P＜0.05)。
在AWR评分方面，当压力为20mmHg时，其他三组的AWR评分相比空白组更为显著，并且差异具有统计学意义(P＜0.05)；当压力为40mmHg时，与模型组相比，经过电针的合募配穴组和常规配穴组的AWR评分均降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；当压力为60mmHg时，合募配穴组和常规配穴组的AWR评分有所降低，与模型组相比差异有统计学意义(P＜0.05)；当压力为80mmHg时，比较各组大鼠的AWR评分，差异无统计学意义(P＞0.05)。
3.各组大鼠肠黏膜形态的观察
空白组结肠黏膜结构完整，绒毛排列较为齐整，无明显的断裂现象，毛细血管清晰，未发现炎性细胞浸润。模型组结肠组织发生损伤现象，上皮结构破坏明显，绒毛排列紊乱，肌层变薄，在黏膜的下层无水肿现象发生。合募配穴组和常规配穴组与模型组相比，结肠黏膜结构较为完整，仍可见少量绒毛脱落，有轻微断裂现象的发生，在中间固有层能够见到肌层存在，黏膜下肌层厚度增加。但各组均无炎性细胞浸润和水肿的发生。
4.各组大鼠结肠组织Occludin和Claudin-1蛋白表达的观察
免疫组化结果显示，与空白组相比，其他组结肠组织中Occludin和Claudin-1的表达明显减少，差异具有统计学意义(P＜0.05)；与模型组比较，经电针干预后的合募配穴组和常规配穴组的蛋白阳性表达有比较显著的升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)；电针干预的两组比较，合募配穴组和常规配穴组的蛋白表达差异明显，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
Westernblot结果显示，在经过造模后，模型组大鼠的Occludin、Claudin-1蛋白表达以及同GAPDH比值出现明显降低(P＜0.05)；但经过电针干预后，合募配穴组和常规配穴组同模型组相比，结肠组织中的Occludin、Claudin-1蛋白表达升高明显，差异具有统计学意义(P＜0.05)。与常规配穴组比较，合募配穴组阳性表达明显较多，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
结论
电针足三里、天枢穴可改善IBS-D大鼠一般情况和抑郁状态，调节内脏高敏感性，上调大鼠结肠组织中Occludin和Claudin-1蛋白的表达，恢复紧密连接结构，并改善肠黏膜屏障功能。
肠易激综合征(irritable bowel syndrome，IBS)是一种常见的功能性胃肠道疾病，该病具有十分典型的临床症状，例如腹痛、腹部不适、排便习惯改变和大便异常[1]。该病的病因和发病机制尚未完全明确，其中肠黏膜屏障功能受损可能为主要因素之一。紧密连接结构作为肠黏膜屏障的重要构成部分，分布于肠黏膜细胞膜的顶端和边缘处，IBS患者在临床中发现大多会存在肠黏膜紧密连接结构的异常和通透性改变，提示上述结构可能与IBS发病有相关性[2]。因此本实验采用急性应激与慢性应激相结合的方法制备IBS-D大鼠模型，在造模的同时使用电针疗法进行干预，从肠黏膜屏障机制入手，以紧密连接结构为切入点，观察电针不同穴位对IBS-D大鼠的行为学、肠上皮黏膜组织形态学改变以及相关蛋白表达的影响，阐明电针对紧密连接结构的保护作用，希望为临床上治疗肠易激综合征提供实验基础。
方法
共使用40只12周龄大的SPF级雄性SD大鼠，体重180-200g，适应性喂养1周后，采用随机数字表法分为四组，每组10只，分别为：空白组、模型组、合募配穴组、常规配穴组。通过急性应激与慢性应激相结合的方法，创建IBS-D大鼠模型，造模时间为28天。在造模的同时对大鼠进行电针干预，空白组饲喂普通饲料，不作其他处理；模型组在造模的同时，每日进行抓取训练、鼠衣穿脱训练；合募配穴组在造模同时采用电针双侧足三里、天枢穴治疗，连续波2HZ，电流强度1mA，每日治疗1次，每次15分钟；常规配穴组在造模同时，采用针刺双侧足三里、上巨虚穴治疗，连续波2HZ，电流强度1mA，每日治疗1次，每次15分钟。造模和电针干预结束后，观察大鼠一般情况及体征、HE染色法观察大鼠结肠组织的形态学改变；免疫组化法(Immunohistochemical)检测结肠组织紧密连接蛋白Occuldin、Claudin-1的阳性表达；免疫印迹法(Western blot)检测结肠中Occuldin、Claudin-1蛋白的表达水平。
结果
1.各组大鼠一般情况和体质量的观察
在大鼠一般情况方面，空白组在造模前后精神状态、活动情况、毛发光泽度和粪便性状无明显变化；模型组在造模中后期出现神情倦怠、行动迟缓、毛发枯黄掉落和粪便稀溏秽臭的情况，提示造模较为成功；合募配穴组和常规配穴组在造模＋干预中后期一般情况明显好转，精神变好，粪便性状由稀溏逐渐变干，提示电针干预对大鼠的一般情况有改善作用。
在大鼠体质量方面，与空白组相比，模型组、合募配穴组和常规配穴组大鼠在造模开始后体重的增长速度有所减缓，差异有统计学意义(P＜0.05)；与模型组相比，在造模＋干预中后期，合募配穴组和常规配穴组体重有较为明显的增长，差异有统计学意义(P＜0.05)；与常规配穴组相比，在造模＋干预后期合募配穴组体重增长幅度较优，差异有统计学意义(P＜0.05)。
2.各组大鼠Bristol评分、糖水偏好结果、AWR评分的比较观察
在大鼠Bristol评分方面，与空白组相比，模型建立后的各组大鼠Bristol评分增加，差异有统计学意义(P＜0.05)；与模型组相比，施以电针干预的两组大鼠其Bristol评分明显降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；比较合募配穴组和常规配穴组，差异无统计学意义(P＞0.05)。
在糖水偏好实验结果的比较中，造模前所有组大鼠的SP值未见明显差异。与空白组相比，模型组、合募配穴组和常规配穴组SP值降低明显，差异有统计学意义(P＜0.05)；与模型组相比，电针后合募配穴组和常规配穴组大鼠的SP值均升高，差异有统计学意义(P＜0.05)；与常规配穴组比较，合募配穴组的SP值相对较高，差异有统计学意义(P＜0.05)。
在AWR评分方面，当压力为20mmHg时，其他三组的AWR评分相比空白组更为显著，并且差异具有统计学意义(P＜0.05)；当压力为40mmHg时，与模型组相比，经过电针的合募配穴组和常规配穴组的AWR评分均降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；当压力为60mmHg时，合募配穴组和常规配穴组的AWR评分有所降低，与模型组相比差异有统计学意义(P＜0.05)；当压力为80mmHg时，比较各组大鼠的AWR评分，差异无统计学意义(P＞0.05)。
3.各组大鼠肠黏膜形态的观察
空白组结肠黏膜结构完整，绒毛排列较为齐整，无明显的断裂现象，毛细血管清晰，未发现炎性细胞浸润。模型组结肠组织发生损伤现象，上皮结构破坏明显，绒毛排列紊乱，肌层变薄，在黏膜的下层无水肿现象发生。合募配穴组和常规配穴组与模型组相比，结肠黏膜结构较为完整，仍可见少量绒毛脱落，有轻微断裂现象的发生，在中间固有层能够见到肌层存在，黏膜下肌层厚度增加。但各组均无炎性细胞浸润和水肿的发生。
4.各组大鼠结肠组织Occludin和Claudin-1蛋白表达的观察
免疫组化结果显示，与空白组相比，其他组结肠组织中Occludin和Claudin-1的表达明显减少，差异具有统计学意义(P＜0.05)；与模型组比较，经电针干预后的合募配穴组和常规配穴组的蛋白阳性表达有比较显著的升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)；电针干预的两组比较，合募配穴组和常规配穴组的蛋白表达差异明显，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
Westernblot结果显示，在经过造模后，模型组大鼠的Occludin、Claudin-1蛋白表达以及同GAPDH比值出现明显降低(P＜0.05)；但经过电针干预后，合募配穴组和常规配穴组同模型组相比，结肠组织中的Occludin、Claudin-1蛋白表达升高明显，差异具有统计学意义(P＜0.05)。与常规配穴组比较，合募配穴组阳性表达明显较多，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
结论
电针足三里、天枢穴可改善IBS-D大鼠一般情况和抑郁状态，调节内脏高敏感性，上调大鼠结肠组织中Occludin和Claudin-1蛋白的表达，恢复紧密连接结构，并改善肠黏膜屏障功能。